G418发酵液的精制纯化工艺制造技术

本发明专利技术提供一种G418发酵液的精制纯化工艺，用草酸调节G418发酵液pH至2.0‑3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩、活性炭脱色和干燥即得G418纯品。本工艺操作步骤简单，产品纯度高，可实现G418稳定、安全高效地生产。

【技术实现步骤摘要】
G418发酵液的精制纯化工艺
本专利技术涉及生物化工领域，具体地说，涉及G418发酵液的精制纯化工艺。
技术介绍
G418(Geneticin，遗传霉素)是由棘孢小单孢菌(Micromonosporaechinospora)、绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)或红橙小单孢菌(Micromonosporarhodorangea)发酵产生的一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。当Neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动Neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得到广泛应用。G418有杀菌作用，本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。棘孢小单孢菌、绛红色小单孢菌或红橙小单孢菌发酵液中主要产物是G418，但还含有多种氨基糖苷类杂质成分，包括庆大霉素B、西索米星、小诺霉素和庆大霉素C等系列组分。这些杂质的理化性质与G418近似，都是水溶性很强的氨基糖苷类抗生素，因此制备高纯度G418极其困难，US3997403中采用两步阴阳离子树脂交换，得到G418产品，但纯度仅90％左右。WO/2012/079039中采用硅胶层析，得到G418纯度达到95％以上的产品，生产成本较高。随着对氨基糖苷类产品提纯方法的不断研究，涌现出许多新的纯化技术，如泡沫分离法、反胶束萃取法、沉淀法和膜分离法等，但上述方法目前仅限于实验室研究，难以实现对G418发酵液的大规模纯化制备。此外，由于缺少G418成品的质量标准，国内厂家生产的成品中G418有效含量较低，一般在90-92％；杂质含量较高，严重影响了G418产品的质量。因此，亟需提供一种新的G418发酵液的精制纯化工艺。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种G418发酵液的精制纯化工艺。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的G418发酵液的精制纯化工艺包括：用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色。前述的方法，用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，搅拌2-3h后加入助滤剂。加入草酸使菌体破壁，同时使发酵液中的金属离子和一些蛋白沉淀，增加上清液产品质量。前述的方法，加入助滤剂搅拌20-40min后再经板框过滤。加入助滤剂有利于增加滤液流速。所述助滤剂可以是硅藻土或珍珠岩，目数为40-100目，助滤剂的用量为G418发酵液体积的2-4％。前述的方法，陶瓷膜过滤中选用多通道陶瓷膜，通道数控制在10-12。优选地，膜材质为玻璃膜，孔径为0.20μm。陶瓷膜过滤时，将流速控制在5-10m/s，压力控制在0.1-0.2MPa，滤液温度控制在40-50℃。陶瓷膜能够进一步去除滤液中的不溶物，使上清液更加清澈透明。前述的方法，阳离子交换树脂可以去除绝大部分的蛋白、无机盐、糖类和脂类等成分，阳离子交换树脂吸附的方法如下：A1、阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h；A2、阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0BV/h，漂洗至洗出液无粉色；然后用0.2mol/L盐酸自上而下淋洗6-8个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.0-5.0。A3、阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束后，用0.5mol/L氨水由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，收集氨水解析液，至流出的氨水解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。前述的方法，阴离子交换树脂脱色包括：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，流速控制在1.5-3.0BV/h，进行脱色，收集脱色液；脱色液颜色为清澈透明或淡黄色，若颜色深，呈现棕色或深黄色，则需重复阴离子交换树脂脱色。所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，其树脂材料的母体结构可以是苯乙烯-二乙烯苯共聚物，其中二乙烯苯在共聚物中的摩尔百分含量为4％-7％。优选地，树脂材料的用量为G418质量的30-50倍，树脂柱的径高比为1:8-10。前述的方法，大孔吸附树脂主要是除去残留在解析液中的小分子蛋白、粘性多糖、脂类和G418的类似物等杂质，大孔吸附树脂吸附的方法如下：B1、大孔吸附树脂上样：将阴离子交换树脂脱色液以2.0-4.0BV/h的流速由上至下进入到大孔树脂柱中，直至树脂柱饱和，停止吸附，静置4.0-6.0h；B2、大孔吸附树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h；B3、大孔吸附树脂洗脱：淋洗结束后，用10％甲醇水溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，洗脱5.0-6.0个柱体积，收集含有G418的甲醇液，然后用0.03mol/L硫酸溶液洗脱，洗脱2.0-4.0个柱体积，收集硫酸解析液，至流出的硫酸解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。所述大孔吸附树脂，其树脂材料的母体结构可以是聚苯乙烯，如Amberlite公司生产的XAD-16。优选地，树脂材料的用量为G418质量含量的10-20倍，树脂柱的径高比为1:8-10。前述的方法，真空浓缩的条件为：50-70℃，真空度-0.06～-0.09MPa，浓缩至原收集液体积的1/8-1/10。前述的方法，经真空浓缩后，向浓缩液中加入活性炭搅拌0.5-1h；静置0.5-1h，整个过程温度控制在55-60℃。优选地，活性炭的目数为80-200目，用量为G418质量含量的1/50-1/20。经活性炭脱色后，进行冷冻干燥，即得G418纯品。冷冻干燥方法为：采用冷冻干燥机，干燥条件为-45～-5℃。真空度20～25Pa，掺入空气条件：1～3s/1min，干燥时间72～84h。本专利技术中，所述G418发酵液可以是棘孢小单孢菌、绛红色小单孢菌或红橙小单孢菌发酵液。与现有技术相比，本专利技术至少具有以下优点：(一)本专利技术通过阴阳离子交换树脂，有效而准确地去除发酵液中无机盐，绝大部分蛋白、多糖、脂类和色素等，再通过大孔吸附树脂吸附，进一步除去残余的小分子蛋白、多糖、脂类、色素和G418的类似物。(二)采用本专利技术的精制纯化工艺生产的成品中G418有效含量高，达到98.5％以上，远高于国内水平。(三)本专利技术避免了常规本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.G418发酵液的精制纯化工艺，其特征在于，包括：用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色。/n

【技术特征摘要】
1.G418发酵液的精制纯化工艺，其特征在于，包括：用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，然后加入助滤剂，充分搅拌，再经板框过滤、得到G418溶液；然后将G418溶液依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色、大孔吸附树脂吸附、真空浓缩和活性炭脱色。


2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，用草酸调节G418发酵液pH至2.0-3.0，搅拌2-3h后加入助滤剂。


3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，加入助滤剂搅拌20-40min后再经板框过滤；
所述助滤剂为硅藻土或珍珠岩，目数为40-100目，助滤剂的用量为G418发酵液体积的2-4％。


4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，陶瓷膜过滤中选用多通道陶瓷膜，通道数控制在10-12；
膜材质为玻璃膜，孔径为0.20μm；
流速控制在5-10m/s，压力控制在0.1-0.2MPa，滤液温度控制在40-50℃。


5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，阳离子交换树脂吸附的方法如下：
A1、阳离子交换树脂上样：将阳离子树脂装入阳性柱内，G418溶液由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h；
A2、阳离子交换树脂淋洗：先用纯化水自上而下洗涤2.0-4.0个柱体积，流速控制在2.0BV/h，漂洗至洗出液无粉色；然后用0.2mol/L盐酸自上而下淋洗6-8个柱体积，流速控制在2.0-4.0BV/h，最后用纯化水淋洗至洗出液的pH4.0-5.0；
A3、阳离子交换树脂洗脱：淋洗结束后，用0.5mol/L氨水由上至下进入树脂柱内，流速控制在2.0-4.0BV/h，收集氨水解析液，至流出的氨水解析液中G418效价低于5.0mg/L时，停止洗脱。


6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，阴离子交换树脂脱色包括：将氨水解析液进入阴离子交换树脂，流速控制在1.5-3.0BV/h，进行脱色，收集脱色液；脱色液颜色为清澈透明或淡黄色，若颜色深，呈现棕色...

【专利技术属性】
技术研发人员：任兆龙，王福聚，李婷婷，
申请(专利权)人：北京泛球生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11