一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用微生物合成7，21‑二羟基‑20‑甲基孕甾‑4‑烯‑3‑酮的方法。本发明专利技术通过两步发酵法，利用卷枝毛霉、直立枝顶孢霉、总状毛霉及烟曲霉中的一种或多种的发酵液将4‑HBC高效转化为7α‑OH‑4‑HBC和7β‑OH‑4‑HBC。在底物4‑HBC投料量为10‑20g/L的条件下，转化率高，从产物中分离得到两种产物，7α‑和7β‑羟基‑4‑HBC,产物总得率为46.5％‑85.32％。本发明专利技术方法操作简便，成本低，得率高，为甾体药物的开发合成提供了新的方法，具有良好的经济价值。

A method of synthesizing 7,21-dihydroxy-20-methyl pregnan-4-ene-3-one by microorganism

The invention provides a method for synthesizing 7,21 dihydroxy 20 methyl pregnant steroid 4 ene 3 ketone by microorganism. The invention utilizes one or more fermentation broths of Mucor cirrhosis, Mucor erectus, Mucor racemosus and Aspergillus fumigatus to efficiently convert 4 HBC to 7a OH 4 HBC and 7b OH 4 HBC by two-step fermentation method. Under the condition of substrate 4 HBC dosage of 10 20g/L, the conversion rate was high. Two products, 7a and 7beta hydroxyl 4 HBC, were separated from the product. The total yield of the product was 46.5%85.32%. The method has the advantages of simple operation, low cost and high yield, provides a new method for the development and synthesis of steroidal drugs, and has good economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法
本专利技术属于微生物发酵技术和甾体化合物生物合成制备
，具体地说，涉及一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法。
技术介绍
甾体化合物广泛分布于自然界及生物体内，是一类重要的生物活性分子，被誉为药学领域的“金蛋”，伴随着微生物转化技术的发展，甾体药物已经成为世界上销售额第二大的药物，仅次于抗生素类药物,全球年产值近100亿美元。21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HBC)可由植物甾醇经生物转化得到，其是合成黄体酮和其它一些肾上腺皮质激素的重要中间体。目前,国家已把甾体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。甾体类中间体7位的羟基化可用化学方法进行，但是这些方法路线长，所用试剂昂贵或有毒，不利于进行大规模生产。利用微生物转化法可以很好的克服化学合成法的不足，还具有高效、低耗、污染少等明显优势，符合现代“绿色化学”的要求。利用微生物转化法开发甾体激素药物新资源,最大的难点在于寻找对甾体具有高转化率、高选择性、高产物得率的优势菌株合成一些具有潜力的新型甾体化合物。目前,对甾体激素类药物中间体具有转化能力的主要是分枝杆菌属(Mycobacterium),其不仅转化周期长、底物转化率低而且易形成其他的多种副产物。另外,甾体激素类药物中间体的羟化产品单一，仅9α、14α、15α的羟化有见报道，关于7α或7β的羟化少见研究。因此利用高转化效率的菌株羟化4-HBC以形成具有生物活性的新型甾体化合物7α,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(7α-OH-4-HBC)和7β,21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(7β-OH-4-HBC)，不仅为甾体药物合成提供了重要的前体化合物，同时可为甾体药物的合成开辟新途径，具有一定的理论研究价值和市场经济价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过微生物发酵途径生物合成新型甾体化合物7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC的方法。本专利技术的技术方案如下：利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法，是将4-HBC加入微生物发酵液，转化得到7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC，所述微生物为卷枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)、直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、总状毛霉(Mucor.racemosus)及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中的一种或多种。优选地，在本专利技术的实施例中，所述微生物分别为保藏编号为CCTCCM2018850的卷枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)GB1、保藏编号为CCTCCM2018851的直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)GB2、保藏编号为CCTCCM2018852的总状毛霉(Mucor.racemosus)GB3及保藏编号为CCTCCM2018853的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)GB4。卷枝毛霉GB1已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为卷枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)，保藏号为CCTCCM2018850。直立枝顶孢霉GB2已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)，保藏号为CCTCCM2018851。总状毛霉GB3已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为总状毛霉(Mucor.racemosus)，保藏号为CCTCCM2018852。烟曲霉GB4已于2018年12月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，中国典型培养物保藏中心，邮编430072)，分类命名为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，保藏号为CCTCCM2018853。所述微生物发酵液为：将卷枝毛霉、直立枝顶孢霉、总状毛霉及烟曲霉中的一种或多种的细胞液体培养物按照占发酵培养基体积比5％-10％加入发酵培养基至对数生长期的液体培养物；所述细胞液体培养物为菌种加入种子液培养后得到的。所述发酵培养基，其1L配方为：葡萄糖30-100g，淀粉20-40g，蛋白胨12-50g，酵母粉10-100g，磷酸二氢钾0.1-1g、磷酸氢二钾0.1-1g、氯化钠0.2-2g、硫酸镁0.05-0.5g、硫酸亚铁0.05-0.5g，加蒸馏水至1L，pH4.0-6.5。所述种子液，其1L配方为：葡萄糖20-50g，蛋白胨10-20g，酵母膏2-5g，磷酸二氢钾1-2g，加蒸馏水至1mL，pH5-6。本专利技术的菌株制备发酵液时培养温度为25-35℃。本专利技术的上述方法中，向发酵液中加入4-HBC，使其初始浓度为10-20g/L。优选地，发酵液中4-HBC的初始浓度为10-19g/L。更优选地，发酵液中4-HBC的初始浓度为12-19g/L。具体地，当发酵菌株为卷枝毛霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为12-18g/L。当发酵菌株为直立枝顶孢霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为12-16g/L。当发酵菌株为总状毛霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为14-17g/L。当发酵菌株为烟曲霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为13-19g/L。最优选地，当发酵菌株为卷枝毛霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为15g/L。当发酵菌株为直立枝顶孢霉菌株时，液中4-HBC的初始浓度为15g/L。当发酵菌株为总状毛霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为14-17g/L。当发酵菌株为烟曲霉时，发酵液中4-HBC的初始浓度为15g/L。将4-HBC加入微生物发酵液后的转化条件为25-30℃，180-250r/min的转速下转化60-80h。本专利技术采用不同的微生物，条件、参数会有针对性的调整，经过反复实验筛选后发现：若用于发酵的微生物为卷枝毛霉时，转化条件为：26-28℃，180-250r/min的转速下转化69-75h。若用于发酵的微生物为直立枝顶孢霉时，转化条件为：26-28℃，180-250r/min的转速下转化67-73h。若用于发酵的微生物为总状毛霉时，转化条件为：25-27℃，180-250r/min的转速下转化75-81h。若用于发酵的微生物为烟曲霉时，转化条件为：28-30℃，180-250r/min的转速下转化63-69h。本专利技术还提供了一种用于发酵合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的微生物，含有保藏编号为CCTCCM2018850的卷枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)、保藏编号为CCTCCM2018851的直立枝顶孢霉(Acr本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物合成7，21‑二羟基‑20‑甲基孕甾‑4‑烯‑3‑酮的方法，其特征在于：将4‑HBC加入微生物发酵液，转化得到7α‑OH‑4‑HBC和7β‑OH‑4‑HBC，所述微生物为卷枝毛霉(Mucor circinelloides lusitanicus)、直立枝顶孢霉(Acremonium strictum)、总状毛霉(Mucor.racemosus)及烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的一种或多种。

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物合成7，21-二羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮的方法，其特征在于：将4-HBC加入微生物发酵液，转化得到7α-OH-4-HBC和7β-OH-4-HBC，所述微生物为卷枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)、直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、总状毛霉(Mucor.racemosus)及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物发酵液为：将卷枝毛霉(Mucorcircinelloideslusitanicus)、直立枝顶孢霉(Acremoniumstrictum)、总状毛霉(Mucor.racemosus)及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中的一种或多种的细胞液体培养物按照占发酵培养基体积比5％-10％加入发酵培养基至对数生长期的液体培养物；所述细胞液体培养物为菌种加入种子液培养后得到的。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基，其1L配方为：葡萄糖30-100g，淀粉20-40g，蛋白胨12-50g，酵母粉10-100g，磷酸二氢钾0.1-1g、磷酸氢二钾0.1-1g、氯化钠0.2-2g、硫酸镁0.05-0.5g、硫酸亚铁0.05-0.5g，加蒸馏水至1L，pH4.0-6.5；所述种子液，其1L配方为：葡萄糖20-50g，蛋白胨10-20g，酵母膏2-5g，磷酸二氢钾1-2g，加蒸馏水至1mL，pH5-6。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养温度为25-35℃。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王福聚，董华强，李小连，孙强，
申请(专利权)人：北京泛球生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11