一种NK细胞的体外激活扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种NK细胞的体外激活扩增方法。具体为从人外周血中分离提取单个核细胞PBMC，在进行NK细胞激活培养的当天采用偶联了生物素标记的2B4抗体与生物素标记的IL

【技术实现步骤摘要】
一种NK细胞的体外激活扩增方法


[0001]本专利技术涉及培养基
，具体为一种NK细胞的体外激活扩增方法领域。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞，即NK细胞（Natural Killer Cell），是与T细胞、B细胞齐名却又不同于两者的一类淋巴细胞，同时对人体内的T淋巴细胞及B淋巴细胞具有一定的调节作用。NK细胞是与特异性免疫应答无关的一类免疫细胞，细胞表型特征CD3
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CD56
+
，它所介导的细胞裂解不受主要组织相溶性复合体（MHC）的影响，而且NK细胞根据其CD56分子表达的密度的差异，将NK细胞分为具有杀伤活性的NK细胞和分泌免疫调控因子的NK细胞两个亚群，具有杀伤活性的NK细胞占NK细胞的90%以上，主要为细胞毒作用，具有很强的杀伤活性；分泌免疫调控因子的NK细胞可产生大量细胞因子，主要起免疫调节作用。作为机体的第一道防线，NK细胞不仅能够清除细胞内寄生菌、病毒及老化变异细胞，对癌细胞也具有极强的清除作用，并且在不发生预先致敏的条件下可实现迅速活化，具备强大的抗感染、抗肿瘤作用。因此，目前在临床上利用NK细胞过继性免疫治疗成为了肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。因此获得足够数量，足够纯度的NK细胞是开展NK细胞药物研发至关重要的一步。但通过目前的几种技术手段培养获得的NK细胞存在以下问题：（1）添加可溶性重组生长因子、IL
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2、IL
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15等常规NK细胞培养方法获得的NK细胞，存在NK细胞纯度低、扩增效率差、杀伤活性不高的缺点。（2）利用K562作为NK细胞扩增培养时的滋养层细胞获得的NK细胞纯度高、扩增好、但杀伤活性一般且不符合GMP标准包括安全性质疑。（3）利用某些刺激性单抗包被细胞培养瓶的底部，不仅操作麻烦，易造成污染，且获得的NK细胞扩增倍数有限，纯度低。（4）利用磁珠偶联多种刺激性因子，包括白介素类细胞因子IL
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15、IL
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21、IL
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18等以及多种抗体分子4
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1BB ligand、CD86、MICA等，操作麻烦，在整个细胞培养过程中需要重复添加，不稳定性因素多，获得的NK细胞质量不一。
[0003]因此，本领域技术人员一直致力于研究一种能够快速有效激活体外NK细胞，通过长期培养能够获得高纯度、高扩增效率、高杀伤活性的NK细胞并且能符合GMP标准和临床使用标准要求的NK细胞激活扩增方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的问题和不足，本专利技术的目的在于提供一种NK细胞的体外激活扩增方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种NK细胞的体外激活扩增方法，从人外周血中分离提取单个核细胞PBMC，在NK细胞培养基对NK细胞进行激活培养当天，在细胞培养悬液中添加偶联了生物素标记的2B4抗体与生物素标记的IL
‑
1β抗体的纳米颗粒悬浮液进行激活培养；所述纳米颗粒与NK细胞的数量比例为1:2；
所述纳米颗粒悬浮液的浓度为1mg/mL；所述生物素标记2B4抗体的浓度为0.1
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0.15mg/mL，所述生物素标记IL
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1β抗体的浓度为0.1
‑
0.15mg/mL。
[0006]较优化的方案，所述生物素标记2B4抗体的浓度为0.1mg/mL，所述生物素标记IL
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1β抗体的浓度为0.1mg/mL。
[0007]较优化的方案，所述的纳米颗粒为可生物降解的基质材料葡聚糖。
[0008]较优化的方案，所述的可生物降解的基质材料葡聚糖为链霉亲和素纳米颗粒。
[0009]较优化的方案，所述的NK细胞培养基为SCGM培养基、康宁KBM581淋巴细胞无血清培养基、宝日医NK细胞无血清培养基中的任意一种。
[0010]较优化的方案，在所述的NK细胞培养基中添加终浓度为500IU/mL的IL
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2、终浓度为500IU/mL的IL
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15、10%热灭活自体血浆。
[0011]较优化的方案，所述NK细胞与靶细胞的效靶比为：1:1~10:1。
[0012]较优化的方案，其特征在于，所述NK细胞与靶细胞的效靶比为：10:1。
[0013]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术提供一种偶联了生物素标记的2B4抗体与生物素标记的IL
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1β抗体的纳米颗粒在NK细胞激活培养当天加入细胞培养悬液中，搭配市面上常见的NK细胞培养基，再联合可溶性细胞因子IL
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15和IL
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2一起使用，在保证NK细胞高活率的同时，又能够使NK细胞快速激活并大量扩增，获得高纯度、高杀伤活性的NK细胞，培养8天的NK细胞的纯度即可达到85%以上，而常规培养至少需要14天，大大缩短了NK细胞CD3
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CD56
+
阳性比例上升的时间，同时NK细胞的杀伤能力也显著提高。采用的纳米级颗粒可被生物降解，不需要磁性分离器，利用此方法在第14天收获细胞时通过离心方法即可将其从培养体系中全部移除，操作简单，有利于细胞药物质量的控制。
[0014]本专利技术的组合物的作用机理是：2B4（CD244）是信号淋巴细胞激活分子（SLAM/CD150）的成员，在所有NK细胞上都有表达，使用2B4抗体与NK细胞表面的2B4蛋白结合，不仅能够刺激激活NK细胞，还能够介导对表达CD48的靶细胞的自然细胞毒性，并诱导细胞内钙的释放，增强NK细胞的杀伤潜能。IL
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1β是淋巴细胞刺激因子IL
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1家族中的重要成员，参与多种自身免疫性炎症反应和多种细胞活动，包括介导NK细胞的活化、增殖与分化，与IL
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2协同可以增强NK细胞活性，且IL
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1β具有较强的促炎活性，使用IL
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1β抗体激活细胞，可诱导多种促炎介质，如细胞因子和趋化因子，可诱导NK细胞对病毒感染细胞的裂解。链霉亲和素
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生物素（SA
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Biotin）系统具有极高的结合亲和力，在生物领域具有广泛的应用。将SA共价连接于固相载体纳米颗粒的表面，可高效结合生物素标记的抗体分子，对NK细胞进行持续高效的激活，激活的NK细胞对靶细胞进行杀伤。因此，本领域技术人员通过检测激活后的NK细胞标志分子CD3
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CD56
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的表达水平来评价NK细胞的纯度以及NK细胞对靶细胞株K562的杀伤效率来判断NK细胞的杀伤潜能。据此可以说明，通过添加一种偶联了2B4与IL
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1β抗体的纳米颗粒悬浮液显著提高了NK细胞的纯度、扩增效率以及杀伤潜力。
附图说明
[0015]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实
施例一起用于解释本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，从人外周血中分离提取单个核细胞PBMC，在NK细胞培养基对NK细胞进行激活培养当天，在细胞培养悬液中添加偶联了生物素标记的2B4抗体与生物素标记的IL
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1β抗体的纳米颗粒悬浮液进行激活培养；所述纳米颗粒与NK细胞的数量比例为1:2；所述纳米颗粒悬浮液的浓度为1mg/mL；所述生物素标记2B4抗体的浓度为0.1
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0.15mg/mL，所述生物素标记IL
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1β抗体的浓度为0.1
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0.15mg/mL。2.根据权利要求1所述的一种NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，所述生物素标记2B4抗体的浓度为0.1mg/mL，所述生物素标记IL
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1β抗体的浓度为0.1mg/mL。3.根据权利要求1所述的一种NK细胞的体外激活扩增方法，其特征在于，所述的纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：马士棋，林家会，程成，詹明高，陈旭，陈刚，
申请(专利权)人：上海吉泰依科赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：