一种碱裂解工艺的大肠杆菌制造技术

本发明专利技术提供一种碱裂解工艺的大肠杆菌

【技术实现步骤摘要】
一种碱裂解工艺的大肠杆菌HCP检测方法


[0001]本专利技术涉及生物制品检测领域，具体为一种碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法
。

技术介绍

[0002]残留宿主蛋白（
Host Cell Proteins
，
HCP
）是来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分，
HCP
组成复杂，种类繁多，既包含细胞分泌蛋白，也包括结构蛋白，而且这些蛋白的理化性质，如等电点
、
疏水性
、
相对分子质量等具有显著差异
。HCP
的存在对于产品的安全性和功效可能产生影响，例如某些
HCP
可以引发生物制品的聚集或片段化，促进聚山梨酯的降解，产生含有降解产物的可见异物从而导致产品不稳定
、
疗效差等质量风险，此外一些
HCP
会引起病人的免疫应答或过敏性反应等安全风险，因此生物制品中
HCP
残留量被认为是产品的关键质量属性之一
。
在对工艺中
HCP
的监控和产品放行中，酶联免疫吸附试验（
ELISA
）一直被用作
HCP
检测的金标准，也是各国药典推荐的在生物制品中检测残留
HCP
的方法，该方法具有操作简便
、
快速
、
高通量等特点
。HCP ELSIA
检测的基本原理是基于
HCP
的多克隆抗体来识别并捕获样品中的
HCP
，采用双抗体夹心进行检测，因此
ELISA
方法高度依赖于试剂盒中
HCP
抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率，然而不同基因背景以及不同工艺处理方式，可能改变细胞系的基因表达谱和
HCP
组分，通用型商业化试剂盒无法针对特定工艺和细胞系检出特异
HCP
，易带来漏检的风险，从而增加了生物制品安全风险
。
[0003]质粒是一种闭合环状的双链超螺旋
DNA
分子，广泛应用于疫苗制备及细胞基因治疗（
CGT
）领域，如
DNA
疫苗
、
裸质粒基因载体
、
腺相关病毒（
AAV
）和慢病毒载体等
。
通常质粒是以大肠杆菌为宿主进行生产，最有代表性的宿主菌是由大肠杆菌
K
‑
12
所衍生出的
DH5a、Stbl3、Top10
等菌株
。
在质粒的生产及纯化过程可能会存在大肠杆菌宿主细胞蛋白（大肠杆菌
HCP
）残留的污染，这些残留
HCP
会给质粒后续应用带来风险，如降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此要对大肠杆菌
HCP
的残留量进行控制
。
不同于常规的使用大肠杆菌表达重组蛋白的工艺过程，质粒的生产纯化最常用工艺是碱裂解工艺，不同于机械裂解的方法，基于大肠杆菌碱裂解工艺过程得到的大肠杆菌
HCP
是一种变性蛋白，
HCP
表位发生了巨大变化，与通用型的大肠杆菌
HCP
检测试剂盒中所用的
HCP
抗体和标准品相比差异大，通用型的检测试剂盒检测值偏低，对质粒载体的质粒控制产生了巨大挑战
。
因碱裂解生产工艺的特殊性，迄今为止仍没有基于碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题
。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法，包括以下步骤：
S1.
碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
的制备，
S11.
培养大肠杆菌获得菌体，
S12.
将步骤
S11
获得的菌体进行碱裂解，具体裂解过程如下，
P1
溶液：
50mM
葡萄糖，
25mM Tris
‑
Cl
，
10mM EDTA
，
pH8.0
重悬步骤
S11
获得的菌体，
P2
溶液：
0.2M NaOH
，
1%SDS
，
pH12.5
裂解
P1
溶液产物， P3
溶液：
3M
醋酸钾，
5M
醋酸沉淀
P2
溶液产物，收集
P3
溶液上清液作为碱裂解产物，
S13.
将步骤
S12
中的碱裂解产物进行超滤浓缩，制得大肠杆菌
HCP
抗原；
S2.
制备兔抗大肠杆菌
HCP
抗体，
S21.
第0天采用弗氏完全佐剂初次免疫新西兰白兔，大肠杆菌
HCP
抗原为
5mg
，
S22.
第
14/28/42/56
天采用弗氏不完全佐剂免疫新西兰白兔，大肠杆菌
HCP
抗原为
2.5mg
，
S23.
第
63
天采血离心，收集抗血清纯化，制得兔抗大肠杆菌
HCP
抗体；
S3.
抗大肠杆菌
HCP
抗体生物素标记，使用
NHS
‑
dPEG12
‑
生物素，对步骤
S2
中制备的兔抗大肠杆菌
HCP
抗体进行生物素标记，制备兔抗大肠杆菌
HCP
生物素化抗体；
S4.
大肠杆菌
HCP ELISA
检测方法建立，
S41.
包被：将步骤
S23
中纯化的兔抗大肠杆菌
HCP
抗体用
pH7.4、0.01M PBS
缓冲液，稀释成1μ
g/mL~8
μ
g/mL
进行包被，每孔加
100
μ
L
，然后用封板膜封口，置于
4℃
包被过夜，
S42.
封闭：甩干除去包被液，
300
μ
L
由1×
PBS+0.05% Tween 20
组成的洗涤液洗涤一次，每孔加入
300
μ
L
由
1%BSA+PBS
组成的封闭液，室本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.
碱裂解工艺的大肠杆菌
HCP
的制备，
S11.
培养大肠杆菌获得菌体，
S12.
将步骤
S11
获得的菌体进行碱裂解，具体裂解过程如下，
P1
溶液：
50mM
葡萄糖，
25mM Tris
‑
Cl
，
10mM EDTA
，
pH8.0
重悬步骤
S11
获得的菌体，
P2
溶液：
0.2M NaOH
，
1%SDS
，
pH12.5
裂解
P1
溶液产物， P3
溶液：
3M
醋酸钾，
5M
醋酸沉淀
P2
溶液产物，收集
P3
溶液上清液作为碱裂解产物，
S13.
将步骤
S12
中的碱裂解产物进行超滤浓缩，制得大肠杆菌
HCP
抗原；
S2.
制备兔抗大肠杆菌
HCP
抗体，
S21.
第0天采用弗氏完全佐剂初次免疫新西兰白兔，大肠杆菌
HCP
抗原为
5mg
，
S22.
第
14/28/42/56
天采用弗氏不完全佐剂免疫新西兰白兔，大肠杆菌
HCP
抗原为
2.5mg
，
S23.
第
63
天采血离心，收集抗血清纯化，制得兔抗大肠杆菌
HCP
抗体；
S3.
抗大肠杆菌
HCP
抗体生物素标记，使用
NHS
‑
dPEG12
‑
生物素，对步骤
S2
中制备的兔抗大肠杆菌
HCP
抗体进行生物素标记，制备兔抗大肠杆菌
HCP
生物素化抗体；
S4.
大肠杆菌
HCP ELISA
检测方法建立，
S41.
包被：将步骤
S23
中纯化的兔抗大肠杆菌
HCP
抗体用
pH7.4、0.01M PBS
缓冲液，稀释成1μ
g/mL~8
μ
g/mL
进行包被，每孔加
100
μ
L
，然后用封板膜封口，置于
4℃
包被过夜，
S42.
封闭：甩干除去包被液，
300
μ
L
由1×
PBS+0.05% Tween 20
组成的洗涤液洗涤一次，每孔加入
300
μ
L
由
1%BSA+PBS
组成的封闭液，室温孵育2小时，甩干除去封闭液，过夜吹干，
S43.
...

【专利技术属性】
技术研发人员：江鹏，陈文峻，秦俭，陈旭，陈刚，
申请(专利权)人：上海吉泰依科赛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：