提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法

【技术实现步骤摘要】
提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法


[0001]本专利技术涉及一种提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法，属于微生物应用

。
[0002]背景领域
[0003]酵母提取物来源于天然酵母，富含小分子氨基酸
、
肽
、
核苷酸
、
维生素等天然活性成分，其中氨基酸可为皮肤所利用，有利于胶原蛋白合成；肽作为信号分子参与多种生物反应，具有抗氧化作用；核酸及核苷酸促进新陈代谢
、
提高蛋白质合成速度
、
增强
SOD
活性，提高皮肤抗自由基能力；维生素
C
及其衍生物具备良好的美白作用
。
因此，酵母提取物具有显著改善皮肤状况的功效，包括减少经皮水分散失
、
改善皮肤粗糙度
、
降低黑色素
、
亮白皮肤
、
改善遗传皮肤过敏症状等，在化妆品领域具有广泛的应用前景
。
[0004]为高效利用酵母胞内营养，充分获得酵母提取物，人们研发了多种破壁方法，包括高压均质法
、
超声波法
、
酶法
、
自溶法
、
脉冲电场等
。
其中，自溶法是利用酵母的酶活，在特定温度和
pH
值下细胞通过自身含有的水解酶将多糖
、
蛋白质和核酸等大分子物质分解成可溶的小分子如还原糖
、
氨基酸和核苷酸等，其具有以下优点：利用酵母自身酶系进行蛋白质分解，蛋白质分解率较其他方法高，游离氨基酸含量高，成本低
。
但由于酵母细胞内源酶活力有限，常借助一些物理
、
化学和生物手段来提高自溶率
。
例如，添加适量的氯化钠或乙醇等促溶剂，使酵母质壁分离，细胞膜功能失调，胞内水解酶溶出，加速自溶过程再促使自溶
。
[0005]现今酵母提取液的制备主要以酿酒酵母
、
啤酒酵母等为原料，有关表达重组胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母发酵菌利用的相关报道极少
。
巴斯德毕赤酵母表达系统在多种类型的外源蛋白表达上优势十分明显，具有易于达到高密度发酵
、
产物高表达的特点
。
重组胶原蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达为分泌表达，蛋白可通过低温高速离心等方式与酵母菌体实现快速分离，分离后菌渣液中仍残留少量胶原蛋白
。
高密度发酵产生了大量的酵母菌渣液，通常占据整个发酵液体积的
35
％左右，需灭活后经环保部门处理方能达到国家排放标准
。
对于规模化发酵分离出的数量庞大的巴斯德毕赤酵母菌体，需要合理有效地利用发酵系统资源基础上，尽可能减少设备占用，采取简单高效的处理方法，降低长时间存储和反应时间长引起的变质问题
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法
。
该方法通过提高发酵罐压力至
0.15
～
0.2MPa
，缩短了溶出时间，且提高了胞内营养物溶出度
。
[0007]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0008]提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法，通过将高密度发酵液依次经过稀释
、
加热裂解
、
低温高速离心
、
除菌过滤处理，获得巴斯德毕赤酵母提取液，具体步骤如下：
[0009](1)
将表达重组人源胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris JY0201
高密度发酵液离心，获得的高密度菌液通入发酵罐中，加入无菌纯化水稀释成菌悬液后，加入促溶剂，调节
pH
为5～7，控制发酵罐压力为
0.15
～
0.2MPa
，并加热至
45
～
80℃
，裂解得到自溶菌
体混悬液；
[0010](2)
将自溶菌体混悬液在
10
～
12℃
下低温高速离心多次，获得澄清透明上清液；
[0011](3)
将上清液除菌过滤，得到巴斯德毕赤酵母提取液
。
[0012]本专利技术所述的表达重组人源胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母
Pichiapastoris JY0201
，其保藏编号为
CGMCC No.16461
，已在中国专利
201811589560.X
公开
。
[0013]优选地，步骤
(1)
中，菌悬液的湿重为
235g/L
～
351g/L
，更优选为
260g/L
～
280g/L。
[0014]优选地，步骤
(1)
中，促溶剂为氯化钠，添加量为
0.02
～
0.06g/mL。
[0015]优选地，步骤
(1)
中，加热裂解时间为8～
48h。
[0016]在本专利技术具体实施方式中，步骤
(1)
中，氯化钠的添加量为
0.036g/mL
，调节
pH
＝
5.4
，加热温度为
60℃
，加热裂解时间为
16h。
[0017]优选地，步骤
(2)
中，高速离心的转速为
8000g
～
14000g
，离心次数为8～9次
。
[0018]优选地，步骤
(3)
中，除菌过滤的具体方法为将上清液先后经
0.45
μ
m、0.22
μ
m
孔径的
PES
滤膜进行二级过滤
。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0020]本专利技术在常规溶出条件下，提高发酵罐压力至
0.15
～
0.2MPa
，使得氨基氮得率和酵母菌破壁率分别提高了
85.901
％
、71.166
％，明显提高了巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平
。
采用本专利技术提取方法获得的巴斯德毕赤酵母提取液中含有
0.62
～
1.56g/L
重组人源
I
型胶原蛋白，其稀释
80
倍
(1.25
％
)
后，在
L929
鼠成纤维细胞实验中未检测出潜在细胞毒性，与
HFF
‑
1、HaCat
表皮细胞反应
10
小时
、
巴斯德毕赤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
提高巴斯德毕赤酵母溶胞物溶出水平的方法，其特征在于，具体步骤如下：（1）将表达重组人源胶原蛋白的巴斯德毕赤酵母
Pichia pastoris JY0201
高密度发酵液离心，获得的高密度菌液通入发酵罐中，加入无菌纯化水稀释成菌悬液后，加入促溶剂，调节
pH
为
5~7
，控制发酵罐压力为
0.15
～
0.2MPa
，并加热至
45
～
80℃
，裂解得到自溶菌体混悬液；（2）将自溶菌体混悬液在
10~12℃
下低温高速离心多次，获得澄清透明上清液；（3）将上清液除菌过滤，得到巴斯德毕赤酵母提取液
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，菌悬液的湿重为
235g/L
～
351g/L。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，菌悬液的湿重为
260g/L
～
...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱逸丽，赵健烽，王菊，季乐，展静，邵吕怡，刘宇乾，孙圣，徐鹏程，
申请(专利权)人：浙江诸暨聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：