【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于重组ⅲ型胶原蛋白鉴别分析，涉及一种重组ⅲ型胶原蛋白的肽图检测方法。
技术介绍
1、近30多年，重组胶原蛋白受到了广泛研究，目前已有多种不同表达体系的重组胶原蛋白类产品，在护肤品、食品和医药领域均有应用。然而，由于各重组胶原蛋白类产品的表达体系等重组工艺不尽相同，所选择的核酸序列长短不同，片段的组合与拼接等千差万别，重组胶原蛋白的鉴别分析成为了该类产品质量评价和质量控制的重要项目。重组胶原蛋白的结构特征决定其生物功能和产品稳定性。《中国药典》中虽有肽图检查法，但因各重组胶原蛋白具有不同的结构特征，常规的检查步骤无法适用于具有不同特征的重组胶原蛋白。此外，肽图检查法通常使用的仪器为质谱仪，该仪器准确度虽高但是价格昂贵，难以满足日常质量监控的低成本、高准确度的要求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种重组ⅲ型胶原蛋白的肽图检测方法。该方法采用高效液相色谱法，得到重组ⅲ型胶原蛋白的肽图，从而满足日常监测。
2、实现本专利技术目的的技术方案如下：
3、重组ⅲ型胶原蛋白的肽图检测方法，包括以下步骤：
4、(1)供试品的溶解：
5、将重组ⅲ型胶原蛋白供试品用0.5％醋酸溶液溶解得到供试品溶液，所述的重组ⅲ型胶原蛋白由保藏编号为cgmcc no.5021的巴斯德毕赤酵母pichiapastoris发酵产生；
6、(2)胰蛋白酶酶解：
7、取供试品溶液置于10kda的超滤管中，加入ph＝8.0、0.1m
8、(3)酸化处理：
9、在酶解后的样品中加入10％甲酸进行酸化；
10、(4)高效液相色谱检测：
11、采用高效液相色谱，取酸化后的样品进样，得到供试品溶液的图谱，色谱条件如下：
12、流动相a：含0.1％甲酸水溶液；
13、流动相b：含0.1％甲酸乙腈溶液；
14、流速：0.22ml/min；
15、柱温：65℃；
16、色谱柱：shim-packarata peptide csh c18(粒径2.2μm，2.0×150mm)；
17、检测波长：214nm；
18、梯度洗脱程序为：
19、 时间(min) a％ b％ 0 98 2 13 85 15 19 79 21 28 70 30 64 30 70 75 98 2
20、。
21、进一步地，步骤(1)中，供试品溶液中，重组ⅲ型胶原蛋白的浓度为1mg/ml。
22、进一步地，步骤(2)中，超滤离心时，tris-hcl溶液与供试品溶液的体积比为1:1。
23、进一步地，步骤(2)中，离心时，离心转速为11000g。
24、进一步地，步骤(2)中，胰蛋白酶溶液与供试品溶液的体积比为1:33，胰蛋白酶溶液的浓度为200μg/ml。
25、进一步地，步骤(3)中，酸化处理时，酶解后样品与10％甲酸溶液的体积比为10:1。
26、与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
27、本专利技术通过控制高效液相色谱中的柱温、流速等色谱条件，确定了重组ⅲ型胶原蛋白的标志性特征峰的时间，从而确定了重组ⅲ型胶原蛋白的高效液相色谱的实验参数，提高了重组ⅲ型胶原蛋白的肽图检测的速度与准确度，为重组ⅲ型胶原蛋白鉴别分析的日常监测提供了有效的方法。
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1.重组Ⅲ型胶原蛋白的肽图检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（1）中，供试品溶液中，重组Ⅲ型胶原蛋白的浓度为1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（2）中，超滤离心时，Tris-HCl溶液与供试品溶液的体积比为1:1。
4. 根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（2）中，离心时，离心转速为11000 g。
5.根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（2）中，胰蛋白酶溶液与供试品溶液的体积比为1:33，胰蛋白酶溶液的浓度为200μg/mL。
6. 根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（3）中，酸化处理时，酶解后样品与10 %甲酸溶液的体积比为10:1。
【技术特征摘要】
1.重组ⅲ型胶原蛋白的肽图检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（1）中，供试品溶液中，重组ⅲ型胶原蛋白的浓度为1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的肽图检测方法，其特征在于，步骤（2）中，超滤离心时，tris-hcl溶液与供试品溶液的体积比为1:1。
4. 根据权利要求1所述的肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦飞，杨佳丹，邵秀萍，
申请(专利权)人：浙江诸暨聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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