利用人多潜能干细胞体外制备T淋巴细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种造血祖细胞和/或T淋巴细胞，及其制备方法与应用。本发明专利技术提供了制备T淋巴细胞的方法，包括以下步骤：(1)将多潜能干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；(2)将步骤(1)获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；(3)将步骤(2)获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得CD34

【技术实现步骤摘要】
利用人多潜能干细胞体外制备T淋巴细胞


[0001]本专利技术属于干细胞分化
，更具体地，本专利技术涉及诱导多潜能干细胞制备造血祖细胞和T淋巴细胞的方法。

技术介绍

[0002]近年来，癌症免疫治疗取得重大进展，为攻克癌症的治疗带来了新希望(Couzin
‑
Frankel,J，2013)。其中，利用表达嵌合抗原受体的T细胞(Chimeric antigen receptor T
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cell，CAR
‑
T细胞)进行的T细胞过继性治疗白血病更是取得了革命性的突破(Grupp SA et al.,2013)。这种方法是通过构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞的活化基序结合为一体，转染自体T细胞(CAR
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T细胞)形成基因编辑后的CAR
‑
T细胞，使得病人自体T细胞具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力。将这种经过基因修饰的CAR
‑
T细胞自体移植回输患者，就可以特异性地杀伤肿瘤细胞。
[0003]然而，CAR
‑
T疗法目前存在T细胞来源有限，制备繁琐，成本过高等问题。人多能干细胞具有自我更新并定向分化成功能细胞的潜力，并且人多能干细胞相对易于进行基因编辑和筛选。因此，人多能干细胞成为建立通用型的，并提供无限的，安全的，功能性的T细胞提供了最佳的种子细胞。在多潜能干细胞制备功能性T细胞方面，Michele Sadelain团队诱导多潜能干细胞获得嵌合CAR
‑
CD19的T细胞，并具有一定的肿瘤杀伤功能(Themeli,M.，2013)。美国Crooks团队利用MS5DLL4基质细胞建立3D体外分化体系，获得了CD8b阳性的T淋巴细胞，但体内杀伤能力较弱(Montel
‑
Hagen A，2018)。日本Shin Kaneko团队在利用多潜能干细胞分化方面取得了进展，建立了基于OP9基质细胞产生多能干细胞来源的T细胞，在体外具有较强的增殖能力和杀伤能力。但是该体系含有血清，不利于临床的转化应用(Minagawa A，2018；Kawai Y,2021)。
[0004]在本研究中，主要采用人化学诱导重编程多潜能干细胞(Guanet al.,2022),基于我们以往的研究基础(Wang et al.,2012)，建立了高效诱导的、化学成分明确的分化方法产生造血祖细胞，再将分化来源的造血祖细胞与表达D LL4的基质细胞共聚集形成类3D结构，或将多潜能干细胞来源的造血祖细胞直接与表达DLL4的基质混合滴到Transwell培养板中进行分化，产生大量的功能性T淋巴细胞。人多潜能干细胞来源的T淋巴细胞表达杀伤特性的标志蛋白，并能在体内体外表现直接杀伤细胞的能力。因此，人多潜能干细胞来源的T淋巴细胞为建立新的免疫疗法辅助肿瘤治疗带来希望。

技术实现思路

[0005]在本专利技术中，我们建立了一个逐级诱导多潜能干细胞向T淋巴细胞分化的策略。该分化过程包括多潜能干细胞向中胚层细胞分化、中胚层细胞向生血内皮细胞分化、生血内皮细胞向造血祖细胞的分化以及造血祖细胞向T淋巴细胞的分化。基于我们之前的研究基础(Wang et al.,2012)，我们进一步优化了中胚层细胞向生血内皮细胞分化以及生血内皮细胞向造血祖细胞分化的方法，能够诱导多潜能干细胞更高效地产生功能更强的造血祖细
胞。这些造血祖细胞能与表达DLL4的基质细胞共聚集，自发形成聚集体，通过与凝胶混合形成类3D结构，在T细胞诱导条件下产生大量功能性的T淋巴细胞。T淋巴细胞分化过程模拟体内T细胞发育进程，通过产生CD34
+
CD7
+
(double negative)的淋巴T细胞祖细胞，再分化产生CD7
+
CD4
+
ISP(intermediate single positive)阶段淋巴细胞，进一步分化产生CD4
+
CD8
+
DP(double positive)细胞和CD4
+
/CD8
+
SP(single positive)细胞。在关键转录因子的表达方面，分化得到的T细胞与胚胎期胸腺T细胞(Thymus
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T)接近，多能干细胞分化来源的T细胞经过CD3/CD28的刺激，可以在体外扩增近100倍，使用在体外扩增后的T细胞进行肿瘤细胞杀伤实验，扩增的T呈现出较强的肿瘤杀伤能力，并且具有特异性肿瘤杀伤能力。该研究为今后开发基于T细胞的免疫疗法提供了无限的细胞来源。
[0006]在本专利技术中，表述“多潜能干细胞”表示诱导多潜能干细胞iPS，或胚胎干细胞。
[0007]具体地，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]1.制备T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
[0009]将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；
[0010]将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；
[0011]将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞，从中分选CD34
+
造血祖细胞；和
[0012]将获得的CD34
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造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞及凝胶混合共聚集，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞(优选杀伤性T淋巴细胞，iNKT淋巴细胞，辅助性T淋巴细胞)；
[0013]在所述获得T淋巴细胞的步骤中，优选将获得的CD34
+
造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞(例如人基质细胞或鼠基质细胞)及凝胶混合共聚集滴到培养板中形成3D结构，或直接与表达DLL4的基质细胞共聚集滴到Transwell板中，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，从而获得T淋巴细胞。
[0014]2.项目1所述的方法，其中，所述中胚层诱导培养基包含BMP4,Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR
‑
99021),bFGF；优选地，所述中胚层诱导培养基包含5
‑
100ng/mL BMP4,3
‑
20μM/mlCHIR
‑
99021、5
‑
100ng/mL bFGF，更优选地包含20ng/mLBMP4、10μM/ml CHIR
‑
99021、20ng/mLbFGF，优选地，所述中胚层诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素
‑
链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸和0.1mM硫代甘油。
[0015]3.项目1或2所述的方法，其中，所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF，T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备T淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：将诱导多能干细胞iPS或胚胎干细胞在中胚层诱导培养基中培养，获得中胚层细胞；将获得的中胚层细胞在生血内皮诱导培养基中培养，获得生血内皮细胞；将获得的生血内皮细胞在造血祖细胞诱导培养基中培养，获得造血祖细胞，从中分选CD34
+
造血祖细胞；和将获得的CD34
+
造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞及凝胶混合共聚集，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，获得T淋巴细胞(优选杀伤性T淋巴细胞，iNKT淋巴细胞，辅助性T淋巴细胞)；在所述获得T淋巴细胞的步骤中，任选地，将获得的CD34
+
造血祖细胞与表达DLL4的基质细胞(例如人基质细胞或鼠基质细胞)及凝胶混合共聚集滴到培养板中形成3D结构，或直接与表达DLL4的基质细胞共聚集滴到Transwell板中，在T淋巴细胞诱导培养基中培养，从而获得T淋巴细胞。2.权利要求1所述的方法，其中，所述中胚层诱导培养基包含BMP4,Wnt信号激活剂(例如WNT 3a,CHIR
‑
99021),bFGF；优选地，所述中胚层诱导培养基包含5
‑
100ng/mL BMP4,3
‑
20
μM
/mlCHIR
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99021、5
‑
100ng/mL bFGF，更优选地包含20ng/mLBMP4、10μM/ml CHIR
‑
99021、20ng/mLbFGF，优选地，所述中胚层诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素
‑
链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸和0.1mM硫代甘油。3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述生血内皮诱导培养基包含BMP4、VEGF、bFGF，TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY
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364947、SB
‑
505或A
‑
83
‑
01)；优选地，所述生血内皮诱导培养基包含5
‑
50ng/ml BMP4、10
‑
100ng/ml VEGF、10
‑
100ng/ml bFGF、5
‑
20μM SB431542，更优选地包含5ng/ml BMP4、50ng/ml VEGF、50ng/ml bFGF、10uM SB431542，优选地，所述生血内皮诱导培养基使用RPMI1640培养基，更优选地，在RPMI1640培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素
‑
链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油。4.权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中，所述造血祖细胞诱导培养基包含VEGF和促造血祖细胞生成因子(例如SCF、Flt3 Ligand,TPO、IL7)和TGFβ受体/ALK5抑制剂；优选地，所述造血祖细胞诱导培养基包含5
‑
100ng/ml VEGF和20
‑
200ng/ml SCF,20
‑
200ng/ml Flt3 Ligand,20
‑
200ng/ml TPO，TGFβ受体/ALK5抑制剂(例如SB431542、LY
‑
364947、SB
‑
505或A
‑
83
‑
01,IL7，更优选地包含5
‑
20ng/ml VEGF和20
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50ng/ml SCF、20
‑
50ng/ml Flt3 Ligand、20
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50ng/ml TPO、5
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20ng/ml IL7，5
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20ng/mL5
‑
20μMSB43154,最优选地包含5ng/ml VEGF、50ng/ml SCF、50ng/ml Flt3 Ligand、50ng/mL TPO，5ng/mL IL7、10μM SB43154，优选地，所述造血祖细胞诱导培养基使用IMDM培养基，更优选地，在IMDM培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素
‑
链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油，2uM minocycline hydrochloride，30uM NAC。5.权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中，所述基质细胞包括但不限于人骨髓基质细胞，人成纤维细胞和人内皮细胞，优选地，所述凝胶包括但不限于Matrigel、VITROGEL、iMatrix 511、PEG，优选包含Matrigel，优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基包含促T细胞生
成细胞因子(如SCF，Flt3 Ligand和IL
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7)，更优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基包含5
‑
100ng/ml SCF，5
‑
100ng/ml Flt3 Ligand和5
‑
100ng/ml IL7；最优选包含10ng/ml SCF和10ng/ml Flt3 Ligand,5ng/mL IL7，优选地，所述T淋巴细胞诱导培养基使用IMDM培养基，更优选地，在IMDM培养基中进一步添加了不含维生素A的B27细胞培养基添加物，50ug/ml维生素C，1％谷氨酰胺，1％青霉素
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链霉素细胞培养添加物，1％非必须氨基酸，0.1mM硫代甘油，2uM minocycline hydrochloride，30uM NAC。6.权利要求1
‑
5任一项所述的方法，其中所述多潜能干细胞为胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞，优选来自哺乳动物，更优选来自小鼠或人，最优选来自人；其中，所述胚胎干细胞为从商业途径获得的胚胎干细胞，优选为下述任一种NIH编号的细胞系的细胞：BG01、BG02、BG03、BG04、SA01、SA02、SA03、ES01、ES02、ES03、ES04、ES05、ES06、TE03、TE32、TE33、TE04、TE06、TE62、TE07、TE72、UC01、UC06、WA01、WA07、WA09、WA13和WA14。7.权利要求1所述的方法，其中所述基质细胞为小鼠骨髓基质细胞及人骨髓基质细胞(例如HS
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5、HS
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27A)；人成纤维细胞(例如WI
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38、IMR
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90、BJ、HFF
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓宏魁，王承艳，来威锋，张颖凤，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：