一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法技术

本申请涉及生物技术领域，尤其是一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，首先是通过淋巴细胞分离液获得外周血单个核细胞PBMCs，然后利用含有唑来膦酸、IL

【技术实现步骤摘要】
一种增强
γδ
T细胞抗肿瘤能力的方法


[0001]本申请涉及生物
，尤其是涉及一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法。

技术介绍

[0002]γδT细胞根据它的表面结构不同，又可分为Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+和Vδ5+等若干个亚群，这群特殊的细胞在人体免疫保护和免疫监视中发挥重要功能。外周血中半数以上的γδT细胞共表达Vδ2链和Vγ9链，这个细胞亚群被称为γδT细胞，仅存在于人类和非人灵长类动物中。人的外周血和淋巴器官中γδT细胞主要是γδT细胞，它们承担了很多抗感染和肿瘤的第一道防御屏障，尤其是来源于健康人群的γδT细胞被认为是肿瘤细胞免疫治疗中一个前景广阔的细胞亚群，更具临床应用价值。γδT细胞被激活后可以表达CD86、MHC
‑
II和CD80等细胞粘附分子，并具有抗原呈递细胞的功能。γδT细胞还表达NK细胞的重要受体NKG2D，所以它具备了T细胞和NK细胞两种免疫细胞的功能。目前培养γδT细胞抗肿瘤活性不高，因此，为了使γδT细胞治疗取得理想的临床治疗效果，需要获得大量具有高抗肿瘤活性的γδT细胞，以满足临床治疗的需要。
[0003]目前，培养γδT细胞抗肿瘤活性不高，因此，为了使γδT细胞治疗取得理想的临床治疗效果，需要获得大量具有高抗肿瘤活性的γδT细胞，以满足临床治疗的需要。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本申请提供了一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，CD137及肠道菌刺激后明显提高了γδT细胞的抗肿瘤活性，在培养10r/>‑
15天即可获得纯度在90％以上的γδT细胞；且本申请操作步骤简单，可操作性强，具有很好的推广价值。
[0005]本申请提供的一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，是通过以下技术方案得以实现的：一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，包括以下步骤：步骤一，制备PBMCs，取外周血采用淋巴细胞分离液分离得PBMCs，并用PBS缓冲液重悬，红细胞裂解液裂解残余红细胞，并在离心下洗涤细胞2次，得PBMCs；步骤二，γδT细胞的刺激培养：在1000 mL的KBM581细胞基础培养基中，加入1.8
‑
2.2mM的双抗，使用γδT细胞刺激培养基重悬PBMCs，并调整密度至3.0
‑
4.0
×
106个细胞/mL，接种于六孔板中，并置于37℃、4.8
‑
5.2%的CO2的条件下，利用含有唑来膦酸、IL
‑
2和IL
‑
15的无血清T细胞培养基进行刺激培养；步骤三，扩增培养：培养至第3 天时，离心后去除培养基，γδT细胞基础培养基将细胞密度调整到1.95
‑
2.05
×
106个细胞/mL，并加入1
‑
500ng/mL的CD137和50
‑
500亿/mL的肠道菌，隔天或隔两天换液，换液所采用的培养液是以第一天的培养液为主，加入1
‑
500ng/mL的CD137和50
‑
500亿/mL的肠道菌所得；培养至第6 天后，换液同第3天换液，并调整细胞密度为1.0
‑
1.05
×
106个/mL，换
液所采用的培养液是以第一天的培养液为主，加入1
‑
500ng/mL的CD137和50
‑
500亿/mL的肠道菌所得，培养至10
‑
15天即可得到具有高杀伤活性γδT细胞。
[0006]本申请无需对PBMCs进行纯化，在培养10
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15天即可获得纯度在90%以上的γδT细胞，所得γδT细胞共表达Vδ2链和Vγ9链。且在CD137和肠道菌刺激后明显提高了γδT细胞的抗肿瘤活性。本申请操作步骤简单，可操作性强，具有很好推广价值。
[0007]优选的，所述肠道菌是由双歧杆菌、乳酸菌复合组成；所述双歧杆菌：乳酸菌的质量比为（0.6
‑
1.2）：（0.6
‑
1.2）。
[0008]优选的，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌中的至少一种；所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌中的至少一种；双歧杆菌：乳酸菌的质量比为1（0.9
‑
1.0）。
[0009]优选的，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌，长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌的质量比为1:0.8:（1.6
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2）；所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌，鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌的质量比为1:1:1；所述双歧杆菌：乳酸菌的质量比为1:1。
[0010]优选的，所述步骤一中的制备PBMCs，具体包括以下步骤：S1.1，采用肝素抗凝的真空采血管抽取一名健康志愿者的100mL外周静脉血，收集新的50mL离心管里；S1.2，取60mL淋巴细胞分离液，平均加到淋巴细胞分离管中，每管15mL，将离心管倾斜，沿管壁缓慢25 mL外周静脉血，在500
‑
1000 g和 25℃下离心25
‑
30 min；S1.3，离心结束后，可以发现离心管中液体可以分为4层，从上到下依次为：血浆层、PBMC絮状层、外周血淋巴细胞分离液层、红细胞层，用巴士吸管先缓慢小心吸掉部分上层血清后，用巴士吸管吸取中层絮状层至新的50 mL离心管中，约20 mL；S1.4，向离心管中加入等倍体积的PBS，约45 mL，在300
‑
600 g 和25℃ 离心10
‑
12 min；离心结束后弃去上清，轻弹管底，各加入5 mL红细胞裂解液，轻柔吹打，常温下裂解5
‑
6min；S1.5，加入5.0倍体积的PBS终止裂解，在400
‑
800g和25℃下离心10
‑
12 min；离心结束后弃去上清，加入2 mL培养基重悬，收集至新的15 mL离心管中，再加入培养基混匀使终体积为10 mL，并进行计数，获得24
‑
26
×
106个PBMCs。
[0011]优选的，所述步骤一中的制备PBMCs，具体包括以下步骤：S1.1，采用肝素抗凝的真空采血管抽取一名健康志愿者的100mL外周静脉血，收集新的50mL离心管里；S1.2，取60mL淋巴细胞分离液，平均加到淋巴细胞分离管中，每管15mL，将离心管倾斜，沿管壁缓慢25 mL外周静脉血，在700
‑
850 g和 25℃下离心25
‑
30 min；S1.3，离心结束后，可以发现离心管中液体可以分为4层，从上到下依次为：血浆层、PBMC絮状层、外周血淋巴细胞分离液层、红细胞层，用巴士吸管先缓慢小心吸掉部分上层血清后，用巴士吸管吸取中层絮状层至新的50 mL离心管中，约20 mL；S1.4，向离心管中加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，制备PBMCs，取外周血采用淋巴细胞分离液分离得PBMCs，并用PBS缓冲液重悬，红细胞裂解液裂解残余红细胞，并在离心下洗涤细胞2次，得PBMCs；步骤二，γδT细胞的刺激培养：在1000 mL的KBM581细胞基础培养基中，加入1.8
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2.2mM的双抗，使用γδT细胞刺激培养基重悬PBMCs，并调整密度至3.0
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4.0
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106个细胞/mL，接种于六孔板中，并置于37℃、4.8
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5.2%的CO2的条件下，利用含有唑来膦酸、IL
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2和IL
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15的无血清T细胞培养基进行刺激培养；步骤三，扩增培养：培养至第3 天时，离心后去除培养基，γδT细胞基础培养基将细胞密度调整到1.95
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2.05
×
106个细胞/mL，并加入1
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500ng/mL的CD137和50
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500亿/mL的肠道菌，隔天或隔两天换液，换液所采用的培养液是以第一天的培养液为主，加入1
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500ng/mL的CD137和50
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500亿/mL的肠道菌所得；培养至第6 天后，换液同第3天换液，并调整细胞密度为1.0
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1.05
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106个/mL，换液所采用的培养液是以第一天的培养液为主，加入1
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500ng/mL的CD137和50
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500亿/mL的肠道菌所得，培养至10
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15天即可得到具有高杀伤活性γδT细胞。2.根据权利要求1所述的一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，其特征在于：所述肠道菌是由双歧杆菌、乳酸菌复合组成；所述双歧杆菌：乳酸菌的质量比为（0.6
‑
1.2）：（0.6
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1.2）。3.根据权利要求2所述的一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，其特征在于：所述双歧杆菌为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌中的至少一种；所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌中的至少一种；双歧杆菌：乳酸菌的质量比为1（0.9
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1.0）。4.根据权利要求2所述的一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，其特征在于：所述双歧杆菌为长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌，长双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌的质量比为1:0.8:（1.6
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2）；所述乳酸菌为鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌，鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌的质量比为1:1:1；所述双歧杆菌：乳酸菌的质量比为1:1。5.根据权利要求1所述的一种增强γδT细胞抗肿瘤能力的方法，其特征在于：所述步骤一中的制备PBMCs，具体包括以下步骤：S1.1，采用肝素抗凝的真空采血管抽取一名健康志愿者的100mL外周静脉血，收集新的50mL离心管里；S1.2，取60mL淋巴细胞分离液，平均加到淋巴细胞分离管中，每管15mL，将离心管倾斜，沿管壁缓慢25 mL外周静脉血，在500
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1000 g和 25℃下离心25
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30 min；S1.3，离心结束后，可以发现离心管中液体可以分为4层，从上到下依次为：血浆层、PBMC絮状层、外周血淋巴细胞分离液层、红细胞层，用巴士吸管先缓慢小心吸掉部分上层血清后，用巴士吸管吸取中层絮状层至新的50 mL离心管中，约20 mL；S1.4，向离心管中加入等倍体积的PBS，约45 mL，在300
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600 g 和25℃ 离心10
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12 min；离心结束后弃去上清，轻弹管底，各加入5 mL红细胞裂解液，轻柔吹打，常温下裂解5
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6min；
S1.5，加入5.0倍体积的PBS终止裂解，在400
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800g和25℃下离心10
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12 min；离心结...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓兆群，吴德龙，柯金铭，
申请(专利权)人：博吉弘康嘉兴生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：