一种镰形扇头蜱的抗凝血分子Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１的基因序列和重组表达与应用制造技术

本发明专利技术提供了镰形扇头蜱抗凝血分子Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１的基因序列及其在大肠杆菌中的重组表达方法。通过构建镰形扇头蜱雌蜱吸血前后的唾液腺消减文库和测序分析，从镰形扇头蜱克隆到一个抗凝血分子Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１的全长编码基因，核苷酸全长６２０ｂｐ，开放阅读框编码１６４个氨基酸残基，预测分子量为１８ｋＤａ，在Ｎ－端有一个１８个氨基酸构成的信号肽序列，并含有一个典型的Ｋｕｎｉｔｚ功能域，该分子与抗凝血分子之一的组织通道抑制因子显著同源。将该基因亚克隆到ｐＧＥＸ－４Ｔ－１表达载体，转化到ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主菌中，经ＩＰＴＧ诱导，重组ＧＳＴ融合蛋白以可溶性的形式高效表达。以纯化的重组蛋白进行兔血浆复钙时间和部分凝血酶激活时间实验，证实Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１分子具有抗凝血生物活性，可用于制备抗凝血生物制剂。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种镰形扇头蜱抗凝血分子Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１基因序列，其特征在于所述基因全长为６２０ｂｐ，在３’端有ｐｏｌｙＡ和ｐｏｌｙＡ的信号序列ＡＡＴＡＡＡ，含有一个完整的开放阅读框，从第４３个碱基到５３６个碱基，编码１６４个氨基酸，其分子量为１８ｋＤａ；其编码蛋白在Ｎ－末端有一个１８个氨基酸构成的信号肽序列，切割点在第１８和第１９个氨基酸间；从第８４个氨基酸至第１３９个氨基酸，预测编码一个典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂Ｋｕｎｉｔｚ功能域；　　所述镰形扇头蜱抗凝血分子Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１的核苷Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　３５　４０　４５　　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＧｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　　５０　５５　６０　　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　　６５　７０　７５　８０　　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　　８５　９０　９５　　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　　１００　１０５　１１０　　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　　１１５　１２０　１２５　　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＬｅｕＣｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　　１３０　１３５　１４０　　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　　１４５　１５０　１５５　１６０　　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　。酸序列和对应的氨基酸序列如下：　　镰形扇头蜱抗凝血分子Ｒｈｉｐｉｌｉｎ－１的核苷酸序列：　　ａａｔａｔｔｇｇａａ　ａａａｃｔｔｃａｇｃ　ｇａｇｃａｇａａａａ　ｃａａｃｃａａａｇｇ　ｃａａｔｇａａｇａｔ　ｔｔｔａｃａａｔａｃ　６０　　ｇｃｇｃｔｃｔｔｇｇ　ｃｔｔｇｔｃｔｔｃｔ　ｃｇｔｃｔｃｇａｔａ　ｔ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周金林，石磊，周勇志，李庄，向飞宇，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]