本发明专利技术涉及一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其具体步骤为，（１）发酵菌种的活化：从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培养基；（２）培养基中添加预处理的固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子；（３）种子液的多级扩大培养过程；（４）接种与发酵：将步骤（２）或（３）培养获得的含发酵菌种的浆液接种于高固含量的发酵罐进行同步糖化发酵制备乙醇或其他生物基产品。本发明专利技术的优点：消除了固液分离获得水解液清液过程中的染菌风险，提高了菌株对抑制物和固体基质的耐受性，过程成本降低，发酵周期缩短，具有很好的工业化应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵与生物质能源
，具体地说，是。
技术介绍
农作物秸秆等纤维质原料是世界上最丰富的可再生资源，利用纤维质原料发酵生 产酒精，用于车用燃料乙醇是一个极具前景的产业。秸秆作为一种丰富的农业副产物，成本 低廉，分布广泛，以它作为原料能够降低生物乙醇的原料成本，扩大乙醇生产规模。纤维质原料发酵生产乙醇一般包括原料的预处理、酶水解、发酵、提纯等步骤。现 有主要的预处理方法包括稀酸预处理和蒸汽汽爆等技术，原料预处理能够破坏纤维质原料 对酶解过程的抵抗性，有利于酶水解的进行，但是预处理过程会产生大量的抑制物，这些抑 制物抑制了发酵微生物在纤维质原料水解液中的生长以及乙醇发酵。为了能够有效的进行 秸秆乙醇发酵，研究者首先提出通过脱除水解液中抑制物的方式来提高发酵效率，包括碱 中和、离子交换、溶剂萃取等方法，这些方法使得过程成本提高，操作复杂，也加大后续乙醇 分离的难度。另一种途径即把发酵微生物培养在含纤维素水解液清液的培养基中，进行驯 化培养，使菌种具备对抑制物的耐受性，再用于乙醇的同步糖化发酵。但是，无论水解液的 脱毒处理或菌种的驯化培养，都需要液固分离设备，这不仅增加设备成本，在液固分离和脱 毒过程都会导致可发酵糖的损失，此外也增大染菌的风险。这就需要一种能够实现低成本 培养乙醇发酵种子液的方法，在工艺上简单可行，同时也能够起到驯化发酵微生物的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以固体秸秆为碳源培养发酵种 子液的方法。本专利技术的构思以固体秸秆类物质为原料发酵生产燃料乙醇过程中种子培养液的 低成本培养方法，适合于以固体秸秆类物质为原料进行乙醇发酵或其它生物基产品发酵的 工业发酵菌种种子培养，菌种在多级培养过程中，向培养基中添加预处理后的固体秸秆作 为碳源，同时加入纤维素酶和营养盐，使种子在培养阶段即采用同步糖化与发酵的方式生长。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的—种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其具体步骤为(1)发酵菌种的活化从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培养基，培 养温度25 45°C，优选温度为30°C;转速50 500rpm，优选转速为150rpm ；培养12 36 小时，OD600值达到4 16 ；在合成培养基中，葡萄糖浓度10 100g/L，营养盐浓度是KH2PO4或K2HPO4O. 5 10g/l，MgSO4 · 7H20 0. 1 5g/l，(NH4)2SO4O. 5 10g/l，酵母萃取粉或玉米浆 0. 1 IOg/1 ；所述的菌种包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株，以及通过诱变、基因工程等操作 改造上述菌株以及上述菌株的两种或数种的混合发酵；优选为酿酒酵母；其中诱变筛选 的菌株是指通过化学、物理以及射线等诱变改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通过转 入质粒、同源重组及改善代谢路径后的可用于代谢六碳糖或五碳糖发酵生产乙醇的菌株；OD600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；(2)培养基中添加预处理的固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子活化的种子液的体积百分数为5 20%接种于固体秸秆的混合培养基中，在混合 培养基中固体秸秆的质量百分数为3 30%，加入纤维素酶和营养盐，转速50 500rpm， 温度25 45°C，培养12 36小时；优选条件为转速150rpm，温度37°C，培养18小时；得 到发酵菌种的浆液；混合培养基是指以0. 1 50g/L葡萄糖溶液调整固体秸秆固含量的培养基，其pH 为2. O 8. 0，优选pH为5. O ；所述的纤维素酶选自纤维素酶或者纤维二糖酶中的一种或两者的混合酶液，加酶 量为1 30FPU/gDM，FPU指纤维素酶液中的纤维素酶滤纸酶活，DM是指秸秆类物质干重； 其中，纤维素酶液包括商品化纤维素酶液以及用霉菌等微生物培养获得的具有纤维素酶活 的培养液；调整PH的溶液选自硫酸、氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液、氨水中的一种或者两种 以上混合溶液；所述的营养盐为KH2PO4 或 K2HPO4O. 5 10g/L，MgSO4 · 7Η200· 1 5g/L， (NH4)2SO4O. 5 10g/l，酵母萃取粉或玉米浆0. 1 10g/L ；所述的固体秸秆选自固体秸秆原料或者固体秸秆处理物；其中所述的固体秸秆原料选自玉米秸秆、麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物 中的一种，优选玉米秸秆；所述的固体秸秆处理物选自采用稀酸、蒸汽爆破、氨气爆破、生物法方式预处理后 的玉米秸秆、麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种，优选蒸汽汽爆预处理的玉 米禾吉秆；(3)种子液的多级扩大培养过程菌种在多级培养过程中，直接向培养基中添加预处理后的固体秸秆作为碳源，根 据发酵罐的装液量大小，扩大培养种子液的体积，将步骤(2)获得的种子液接种于含固体 秸秆的培养基，在培养基中固体秸秆的质量百分数为3 30%，加入纤维素酶和营养盐，在 摇瓶或种子罐中扩大培养种子，培养转速100 500rpm，温度25 45°C，培养12 36小 时，获得种子培养液；种子液多级培养过程中培养级数涵盖1级到6级，各培养级间接种量 的体积百分比为5 20%，接种于发酵罐的种子液包括从1级到6级培养种子获得的任一 级的培养液；得到含发酵菌种的浆液；(4)接种与发酵将步骤⑵或(3)培养获得的含发酵菌种的浆液接种于高固含量的发酵罐进行同 步糖化发酵制备乙醇或其他生物基产品。与现有技术相比，本专利技术的积极效果是(1)本专利技术基于低固体含量同步糖化培养种子，在种子多级培养过程中，向培养基 中添加预处理后的玉米秸秆作为碳源，提高了种子在纤维乙醇发酵过程中的耐受性，适合 于高固体含量乙醇同步糖化发酵过程接种，发酵周期缩短，提高了乙醇产率和得率，适合于 工业应用；(2)本专利技术基于低固体含量同步糖化培养种子，与采用合成培养基或与采用秸秆 水解液清液获得的种子培养液相比，避免了固液分离过程可发酵糖的损失，消除了固液分 离获得水解液清液过程中的染菌风险，提高了原料的利用率，能够实现纤维质原料发酵生 产乙醇过程的可行性；(3)同现有技术相比，本专利技术没有液固分离和水解液脱毒过程，减少了固定设备投 资，同时采用低成本营养盐以及易于操作的工艺过程，充分利用水解液资源，降低了生产成 本，适合于大规模和工业化生产。具体实施方式以下提供本专利技术的具体实施方式。实施例1在IOOmL摇瓶中加入20mL合成培养基做菌种的活化，菌种为酿酒酵母；种子培养 第二步，在250mL摇瓶中用20g/L的葡萄糖溶液调整汽爆预处理秸秆含量为15%，培养温 度30°C，150rpm;加酶量5FPU/g DM，培养18小时。同步糖化发酵在发酵罐中进行，固体含 量为 25%，加酶量 7FPU/gDM，营养盐浓度分别为 KH2P042g/L，MgSO4 · 7H202g/L，(NH4)2SO4Ig/ L，酵母萃取粉lg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以固体秸秆为碳源培养发酵种子液的方法，其特征在于，其具体步骤为： （１）发酵菌种的活化： 从菌种保藏平板、保藏斜面或冷冻甘油保藏管保存的菌种接种于合成培养基，培养温度２５～４５℃；转速５０～５００ｒｐｍ；培养１２～３６小时，ＯＤ↓［６００］值达到４～１６； 在合成培养基中，葡萄糖浓度１０～１００ｇ／Ｌ，营养盐浓度是ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］或Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］０．５～１０ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ ０．１～５ｇ／ｌ，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４）接种与发酵： 将步骤（２）或（３）培养获得的含发酵菌种的浆液接种于高固含量的发酵罐进行同步糖化发酵制备乙醇或其他生物基产品。４］０．５～１０ｇ／１，酵母萃取粉或玉米浆０．１～１０ｇ／ｌ； 所述的菌种包括酿酒酵母、管囊酵母、树干毕赤酵母、克鲁维酵母、运动发酵单胞菌菌株，以及通过诱变、基因工程等操作改造上述菌株以及上述菌株的两种或数种的混合发酵；其中：诱变筛选的菌株是指通过化学、物理以及射线诱变改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通过转入质粒、同源重组及改善代谢路径后的用于代谢六碳糖或五碳糖发酵生产乙醇的菌株； ＯＤ↓［６００］值是指含有菌体的溶液在６００ｎｍ波长处的吸光值； （２）培养基中添加预处理的固体秸秆进行同步糖化驯化培养种子： 活化的种子液的体积百分数为５～２０％接种于固体秸秆的混合培养基中，在混合培养基中固体秸秆的质量百分数为３～３０％，加入纤维素酶和营养盐，转速５０～５００ｒｐｍ，温度２５～４５℃，培养１２～３６小时，得到发酵菌种的浆液； 混合培养基是指以０．１～５０ｇ／Ｌ葡萄糖溶液调整固体秸秆固含量的培养基，其ｐＨ为２．０～８．０； 所述的纤维素酶选自纤维素酶或者纤维二糖酶中的一种或两者的混合酶液，加酶量为１～３０ＦＰＵ／ｇＤＭ，ＦＰＵ指纤维素酶液中的纤维素酶滤纸酶活，ＤＭ是指秸秆类物质干重；其中，纤维素酶液包括商品化纤维素酶液以及用霉菌等微生物培养获得的具有纤维素酶活的培养液；调整ｐＨ的溶液选自硫酸、氢氧化钙溶液、氢氧化钠溶液或者氨水中的一种或者两种以上混合溶液； 所述的营养盐为ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］或Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］０．５～１０ｇ／ＬＬ，ＭｇＳＯ↓［４］.７Ｈ↓［２］Ｏ ０．１～５ｇ／Ｌ，（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］０．５～１０ｇ／ｌ，酵母萃取粉或玉米浆０．１～１０ｇ／Ｌ；所述的固体秸秆选自...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：鲍杰，楚德强，张建，毕德玺，朱培，芦晨阳，范超，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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