一种检测氯霉素的酶联免疫试剂及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶联板；酶标记物；氯霉素特异性抗体；氯霉素标准品溶液；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；浓缩复溶液。氯霉素包被抗原是采用活泼酯法将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到，所述抗体为多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明专利技术还提供了一种检测动物源性食品中氯霉素的方法，包括了以下步骤：样品前处理；用试剂盒的试剂进行检测；分析检测结果。本发明专利技术的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测动物源性食品氯霉素的酶联免疫试剂盒及检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫和兽药残留检测分析
中的一种检 测氯霉素的酶联免疫试剂及方法。
技术介绍
氯霉素(chloramphenicol, CAP)是第一个采用化学合成法生产的 抗生素，对多种病原菌具有较强的抑制作用。由于其效高价廉，曾被 广泛应用于各类家禽、家畜、蜜蜂和水产品的各种传染病的防治。然 而，氯霉素存在着严重的毒副作用，能引起人的再生障碍性贫血、粒 状白细胞缺症以及新生儿、早产儿灰色综合症等，对人类健康构成巨 大的潜在威胁。因此，氯霉素残留问题已引起国际组织和许多国家及 地区的高度重视。欧盟、美国等发达国家已相继禁止氯霉素用于动物 源性食品，并明确规定氯霉素残留限量为不得检出。目前国内外的氯霉素检测技术方法主要有微生物法、放射免疫 法、气相色谱法(GQ 、液相色谱法(HPLC)、质谱分析等，这些方法 各有优劣,而酶联免疫法(ELISA)具有特异性强、灵敏度高,样品预处 理简单，检测时间短、检测样本量大等优点。
技术实现思路
本专利技术的检测原理当包被原为氯霉素偶联抗原时是将氯霉素半 抗原与牛丙种球蛋白偶联物(CAP-BGG)吸附于固相载体上，加入样本或氯霉素标准品，然后加氯霉素特异性抗体，待测样品中残留的 氯霉素和酶标板上包被的氯霉素抗原竞争氯霉素特异性抗体。再加入 酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光 度值，该值与样品中氯霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得 出氯霉素的浓度。包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入氯霉素特 异性抗体，再加入氯霉素酶标记抗原和样本或氯霉素标准品溶液，待 测样本中残留的氯霉素和酶标记氯霉素抗原竞争氯霉素特异性抗体， 显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氯霉素残留量呈负 相关，与标准曲线比较即可得出氯霉素的浓度，与标准溶液颜色比较 则可判断样品中氯霉素的浓度范围。本专利技术提供了一种检测动物源性食品中氯霉素的酶联免疫试剂 盒，它含有(1) 包被氯霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2) 酶标记物；(3) 氯霉素特异性抗体；(4) 氯霉素标准品溶液；(5) 底物显色液；(6) 终止液；(7) 浓缩洗涤液；(8) 浓缩复溶液。本专利技术所述试剂盒中氯霉素包被抗原是采用活泼酯法将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或 羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊 进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为批pH值9.6、 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被氯霉素抗原或抗抗体的载体物质可 为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、 玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板 凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为去离子水或三蒸水；所用的 封闭液是含有8%-15%的马血清和1%惰性蛋白的溶液。本专利技术所述试剂盒中包被氯霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的 酶联板的制备步骤为-(1) 用包被缓冲液将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白(BGG)偶联物 或抗抗体以0.02-0.08ng/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；(2) 向酶联板的每孔中加入10(^1已经稀释好的抗原稀释液或抗 抗体稀释液，37"C温育2h，倾去包被液，用洗漆液洗涤4次，每次 15-30s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150-200nl封闭液，37"C温育l-2h， 倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试 验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。本专利技术所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记氯霉素 抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本专利技术优选过氧化物酶;酶标记物形式可为冻干粉、浓縮液和工作液；酶标记物工作液所用的 稀释液为含有50%甘油(可防止放入-201:环境的酶标记物冻结，亦可 长时间保持酶标记物的生物活性)、1%的叠氮化钠防腐剂(便于保存) 的溶液。本专利技术所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为(1) 抗抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行 免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原体山羊 进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。(2) 过氧化物酶标记抗抗体的制备将抗抗体与过氧化物酶(HRP) 进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗体与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA—步法偶联反应不易控制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决这些问题， 我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在被偶联的两 种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶连剂活化，然后去处多余的偶连剂；第二步将一端与某种分子连接的偶连剂，通过改变 反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁，但偶连效 率提高，而且形成的同分子聚合物减少。本专利技术所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性酯法将标记酶与氯 霉素半抗原进行偶联得到。本专利技术所述试剂盒中氯霉素特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔 源多克隆抗体，免疫原是采用活泼酯法将氯霉素半抗原与钥孔槭血蓝 蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓縮液、工作液；抗体稀释液为pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%马血清和596。明胶的磷酸盐 缓冲液。本专利技术所述试剂盒中氯霉素特异性抗体可为单克隆抗体或多克 隆抗体，其制备方法如下(1)氯霉素单克隆抗体制备的步骤为a. 动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(氯霉 素半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80-100吗/只，首免 时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点 注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化， 加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；b. 细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5-10: 1 比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清 液，筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳 定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；c. 细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液 制成1-5><106个/1111的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存， 复苏时取出冻存管，立即放入37。C水浴中速融，离心去除冻存液后， 移入培养瓶内培养；d. 单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠 (8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细 胞5xl0、l(^个/只，7-10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹 水纯化，小瓶分装，-20°(:保存；e. 抗体冻干粉可将腹水在37'C环境下烘干，放入-2(TC保存；f. 抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02-0.08pg/ml浓度进行 稀释。(2)氯霉素多克隆抗体制备的步骤为采用新西兰大白兔作为免疫动物，免疫原(氯霉素半抗原与钥孔 槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为lmg/kg，首免时将免疫原与等量的 弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取 相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测动物源性食品中氯霉素的酶联免疫试剂盒，其特征是，它含有：　（１）包被氯霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；　（２）酶标记物；　（３）氯霉素特异性抗体；　（４）氯霉素标准品溶液；　（５）底物显色液；　 　（６）终止液；　（７）浓缩洗涤液；　（８）浓缩复溶液；　试剂盒中氯霉素包被抗原是采用活泼酯法将氯霉素半抗原与牛丙种球蛋白进行偶联得到的，抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊 进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：聂继斌，唐俊，杨宏，温俊梅，齐欣，吴青，李成，杨宗繁，
申请(专利权)人：深圳市绿诗源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]