一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法，涉及生物医学技术领域。本发明专利技术从猪SCD1基因中分离出1个基因编辑靶位点，从猪SCD5基因中分离出2个基因编辑靶位点，均可应用于基因编辑。统计结果表明，以上位点的打靶效率分别为90％和82％。提供的猪SCD1和SCD5双基因编辑位点为对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员进行精确编辑提供了有效靶标，同时提供了一个猪SCD1和SCD5双基因突变的细胞模型，为脂质代谢及猪种肉质改良提供了可靠的研究材料，也为优良肉质猪品种的研究和开发提供了新策略。优良肉质猪品种的研究和开发提供了新策略。优良肉质猪品种的研究和开发提供了新策略。

【技术实现步骤摘要】
一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法。

技术介绍

[0002]基因编辑技术发展至今，已在动物基因功能研究及畜禽改良育种领域得到了广泛的应用。基因编辑主要是通过对目的基因进行修饰、敲除及插入进而影响其表达和功能，目前主要有锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术以及成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)技术，特别是CRISPR
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Cas9基因编辑技术的发现和广泛的应用，使得在目标基因组中能够简单、高效地完成碱基的删除、插入和替换等修饰。相比于ZFNs和TALEN技术，CRISPR
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Cas9系统的构建和使用更加便捷精准高效和更短周期更低成本，并且其具有同时对多个基因进行编辑修饰的巨大潜力。
[0003]脂肪沉积是指脂肪组织的形成过程，脂肪组织由成熟的脂肪细胞经过变大、增殖和聚集而形成。脂肪细胞的大部分空间被脂质液滴(Lipid droplets，LD)占据，LD是由甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)的疏水核心和胆固醇酯组成的脂肪储存细胞器，可以在几乎所有细胞中形成。在LD核心中，初级中性脂质是甾醇酯和TAG，其主要形式是TAG(Guo et al.,2009b)。LD包括脂肪酶、膜运输和结构蛋白的酶，参与脂质合成，通过含有各种蛋白质的磷脂单层将疏水核心与水性胞质溶胶分离。甘油三酯是含量最为丰富的一类脂肪，多为含16个或18个碳原子的饱和脂肪酸(SFAs)及不饱和脂肪酸(UFAs)，SFAs与UFAs尤其是硬脂酸与油酸的不同比例能调节细胞膜流动性和信号转导，进而影响细胞的生长和分化。
[0004]哺乳动物硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是一种普遍表达的脂肪酸Δ9去饱和酶，是SFA转化为MUFA的一种限速酶。现已鉴别出5种SCD亚型，但在猪上，目前只发现SCD1及SCD5亚型，且这2个亚型具有66.3％的核酸相似度和61.7％的氨基酸相似度，均显示出相似的Δ9去饱和酶活性，特别是其特异性催化16：0和18：0形成16：1和18：1，是一个脂肪酸代谢控制的重要靶点。SCD介导的这两种脂肪酸代谢的紊乱与人类的几种常见疾病有关，包括肥胖、糖尿病、脂肪肝以及心血管和肿瘤疾病(Richard et al.,2009)。且研究表明SCD缺失的小鼠能够抵抗高碳水和高脂饲粮导致的肥胖和脂肪酸变性(Ntmabi et al.,2002)。
[0005]猪SCD1基因位于14号染色体上，包含6个外显子，编码359个氨基酸。主要在脂肪组织、大脑、肝脏和肌肉组织中表达，可作为肌内脂肪沉积的潜在生物标志物，其基因标记可用于选择猪肉的最佳脂肪酸谱。SCD5也叫ACOD4、FADS4，猪SCD5基因位于8号染色体上，包含5个外显子，编码332个氨基酸。在大脑、肾脏和肌肉组织中表达，现已被证明在脂肪酸组成和脂肪沉积中发挥重要作用(Ren et al.,2020)。
[0006]虽然已有研究针对SCD1和SCD5之间的补偿效应进行了部分探讨，但均仅仅局限于单个基因成员的功能研究，仍然缺乏对其基因家族整体生物学功能作用的揭示，且由于SCD5目前被发现仅存在于包括人类在内的几种脊椎动物中，导致对其的研究受到较大的限
制，现有研究不足以阐述完全其具体功能作用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种猪SCD基因家族成员双基因突变细胞、突变细胞系及突变动物的构建方法，构建SCD1和SCD5双基因突变的细胞模型，为脂质代谢及猪种肉质改良提供研究材料和方法。
[0008]本专利技术提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的方法，以猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点作为标靶，所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
[0009]优选的，所述SCD1的编辑位点包括SEQ ID No.1所示的序列；
[0010]所述SCD5的编辑位点包括SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的序列。
[0011]本专利技术提供了一组针对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点设计的sgRNA，包括针对SCD1设计的sgRNA1
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F和sgRNA1
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R，所述sgRNA1
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述sgRNA1
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
[0012]针对SCD5设计的sgRNA2
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F、sgRNA2
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R、sgRNA3
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F和sgRNA3
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R，所述sgRNA2
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA2
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述sgRNA3
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述sgRNA3
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
[0013]所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
[0014]本专利技术还提供了一组制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的Cas9gRNA表达载体，所述Cas9gRNA表达载体分别含有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点；
[0015]所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。
[0016]优选的，以pSpCas9(BB)
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2A
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Puro载体为骨架。
[0017]本专利技术还提供了一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞系的方法，包括以下步骤：(1)将上述sgRNA中的sgRNA1
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F和sgRNA1
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R、sgRNA2
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F和sgRNA2
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R以及sgRNA3
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F和sgRNA3
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R分别退火后，连接进线性化的pSpCas9(BB)
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2A
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Puro载体中，得Cas9gRNA表达载体PX459
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SCD1
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sgRNA1、PX459
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SCD5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的方法，其特征在于，以猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点作为标靶，所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述SCD1的编辑位点包括SEQ ID No.1所示的序列；所述SCD5的编辑位点包括SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3所示的序列。3.一组针对猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点设计的sgRNA，其特征在于，包括针对SCD1设计的sgRNA1
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F和sgRNA1
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R，所述sgRNA1
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述sgRNA1
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；针对SCD5设计的sgRNA2
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F、sgRNA2
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R、sgRNA3
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F和sgRNA3
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R，所述sgRNA2
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA2
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述sgRNA3
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F的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述sgRNA3
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R的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323～345bp处。4.一组制备猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员双基因突变细胞的Cas9gRNA表达载体，其特征在于，所述Cas9gRNA表达载体分别含有猪硬脂酰辅酶A去饱和酶基因家族成员SCD1和SCD5的编辑位点；所述SCD1的编辑位点位于NC_010456.5的462～484bp处，所述SCD5的编辑位点位于NC_010450.4的12～34bp处和/或323...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕延震，方钱海，任红艳，顾浩，陈矾，周昌繁，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：