一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L-木糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L

【技术实现步骤摘要】
一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L
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木糖的方法


[0001]本专利技术涉及一种生物合成L
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木糖的方法，尤其涉及一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L
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木糖的方法，属于生物


技术介绍

[0002]稀有糖是一类自然界中极少存在的单糖及其衍生物，在无热量甜味剂、抗病毒药物、抗癌或肿瘤治疗药物、药物构建前体和L
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核苷类似物等方面具有巨大的应用潜力。近年来，人们对L
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碳水化合物及其核苷类化合物的研究越来越多。
[0003]L
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木糖是一种醛戊糖，已被用作合成许多药用分子的原始材料。据相关报道，新型L
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木糖衍生物在体内对尿糖重吸收有抑制作用，提示其可能用于治疗糖尿病。L
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木糖还可用作生产多羟基吡咯烷和相关类似物的前体，能够抑制肿瘤生长，作为α和β
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葡萄糖苷酶抑制剂，用于生产抗HBV的核苷类药物。此外，L
‑/>木糖通过氧化还原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用双酶级联重组大肠杆菌催化木糖醇生物合成L
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木糖的方法，步骤是：(1)合成木糖醇
‑4‑
脱氢酶基因和L
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海藻糖异构酶基因木糖醇
‑4‑
脱氢酶基因xdh的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或是与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；L
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海藻糖异构酶基因L
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fucI的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，或是与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有95％以上同源性且编码与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列；(2)构建重组质粒pET28a
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xdh/L
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fucI将木糖醇
‑4‑
脱氢酶基因xdh连接到载体质粒pET28a的限制性酶切位点BamHI和Hind III之间，构建得到重组质粒pET28a
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xdh；将L
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海藻糖异构酶基因L
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fucI连接到重组质粒pET28a
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xdh的限制性酶切位点HindIII和Xho I之间，得到重组质粒pET28a
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xdh/L
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fucI；其中PCR克隆获得的L
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海藻糖异构酶基因L
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fucI所用上游引物含有核糖体结合位点AAGGAG；(3)构建重组菌株将重组质粒pET28a
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xdh/L
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fucI以1:10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴30min，再在42℃水浴中热击45s，立即冰浴2min，而后加入LB液体培养基中37℃，200rpm复苏1h，再将菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，37℃静置培养过夜；挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为50μg/ml，37℃，200rpm培养12h，得到重组菌株；其中，所述感受态细胞是E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)，得到的重组菌株相应是E.coli DH5
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pET28a
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xdh/L
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fucI或E.coli BL21(DE3)
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pET28a
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xdh/L
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fucI；(4)诱导培养收集菌体将重组菌株E.coli BL21(DE3)
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pET28a
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xdh/L
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fucI接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD
600
为0.6，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM，并将温度降低到25℃继续诱导培养12h；培养后的菌液10000rpm离心5min收集菌体；(5)利用收集的菌体作为生物催化剂转化木糖醇生产L
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木糖将收集的菌体用50mM、pH 10.0的甘氨酸
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氢氧化钠缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建强，安高，温鑫，林建群，
申请(专利权)人：青岛龙鼎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：