一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用含有NAD(P)

【技术实现步骤摘要】
一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法


[0001]本专利技术属于稀有糖生物转化
，具体涉及一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法。

技术介绍

[0002]随着经济的蓬勃发展，人民的生活水平得到极大地改善，但是与此同时亚健康人员增多，高血压、糖尿病、肥胖人群与日俱增，具有低热量、低吸收等特点的稀有糖引起人们的广泛关注。稀有糖被国际稀有糖协会（International Society of Rare Sugars，ISRS）定义为自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。
[0003]D-阿洛酮糖是一种超低热量稀有糖，虽具有糖的甜味，但甜度是蔗糖的70%，不会被人体代谢利用，是蔗糖和高果糖浆的理想替代品。D-阿洛酮糖可以改善食品质地，减少食品加工过程中的氧化，增加食品保水能力，从而提供食品愉悦口感。另外，D-阿洛酮糖还是一种有效的抗肥胖和抗糖尿病的甜味剂，它能抑制血糖升高，提高胰岛素敏感性，降低餐后血糖反应，抑制肝脏脂肪生成酶活性，减少腹部脂肪堆积，清除活性氧等。D-阿洛酮糖被美国食品和药物管理局(FDA)批准为“一般认为是安全的”(GRAS，GRN No. 400)，并被允许用作食品和膳食补充剂的成分。
[0004]自然界的D-阿洛酮糖主要存在于甘蔗、小麦和鼠刺等植物中，含量微少，不利于大量生产D-阿洛酮糖。虽然利用化学合成法可以实现D-阿洛酮糖的生产，但是该方法操作复杂，副产物多，不利于后期D-阿洛酮糖的分离纯化，且对环境不友好。
[0005]目前，D-阿洛酮糖主要通过差向异构酶（如D-阿洛酮糖 3-差向异构酶或D-塔格糖 3-差向异构酶）催化D-果糖的方式得到，但反应平衡点不利于D-阿洛酮糖的生成，转化率较低，仅在30%左右，因此造成分离纯化困难，不利于高效率、低成本地大规模工业化生产D-阿洛酮糖。
[0006]另外，根据稀有糖生物转化策略（Izumoring策略），D-阿洛酮糖也可以通过生物氧化反应，由阿洛醇生物转化得到。菌株Bacillus pallidus Y25和Enterobacter aerogenes IK7的静息细胞反应可以实现由阿洛醇直接生产D-阿洛酮糖，该微生物转化法制备D-阿洛酮糖，虽不涉及热力学平衡问题，且工艺步骤简单，但微生物的存在底物浓度低、催化时间长、生产周期长、反应条件各异，产物提取工艺复杂等问题，也会导致总成本偏高，不适合工业化生产。因此，探索一种操作简单，成本低，可以实现D-阿洛酮糖的规模化生产的方法就显得非常重要。

技术实现思路

[0007]为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，该方法首次通过含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株实现了由阿洛醇生产D-阿洛酮糖，且方法简单、转化率高。
[0008]为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：本专利技术提供了一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：（1）构建重组质粒pETDuet-1-MCSⅡadh：将NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因连接到载体质粒pETDuet-1
的限制性酶切位点NdeⅠ和 Xho
ꢀⅠ
之间，得到重组质粒 pETDuet-1-MCSⅡadh；（2）构建重组菌株：将重组质粒以1：10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴后热击，再立即冰浴，而后加入无菌无抗生素的LB液体培养基中复苏，再将菌液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，静置培养过夜；从平板挑取单菌落转接至LB培养基中，并添加氨苄青霉素至浓度为100 μg/ml，摇床培养后得到重组菌株；（3）制备D-阿洛酮糖：将重组菌株按照1%的接种量接种到含有氨苄青霉素的LBG培养基中，37 ℃摇床培养，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM，再将温度降低到20 ℃，继续摇床诱导培养；诱导培养后的菌液离心收集菌体，并用pH为10.0、浓度为20 mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液洗涤菌体三次后，离心收集菌体；然后用100 g/L的阿洛醇溶液重悬菌体至细胞用量OD
600
为80，置于50 ℃的摇床中反应12 h；将反应液14000 rpm离心去除菌体取上清液，上清液煮沸后再离心，或经0.22 μm孔径超滤膜滤器过滤，得到的清液中即含有D-阿洛酮糖。
[0009]进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶来源于Gluconobacter frateurii。
[0010]进一步的，所述NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因是根据NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的原始序列，按照大肠杆菌密码子分析用表对原始基因序列进行密码子优化后合成获得的。
[0011]进一步的，所述步骤（1）中的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因具有下列核苷酸序列之一：（1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；（2）与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。
[0012]进一步的，所述步骤（3）中的阿洛醇溶液是由pH为10.0、浓度为20 mM的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制得到的。
[0013]进一步的，所述LBG液体培养基包括10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠和5 g/L葡萄糖。
[0014]进一步的，所述清液中D-阿洛酮糖的浓度高于50 g/L。
[0015]进一步的，所述D-阿洛酮糖的转化率高于50%。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的具有以下优点：本专利技术是首次利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶（ADH）的重组菌株作为生物催化剂，催化阿洛醇转化生产D-阿洛酮糖。本专利技术方法简单、快速，通过离心的方式即可容易地得到细胞催化剂，不需要额外对酶进行纯化或是固定化等耗时耗力的操作，并且反应条件温和、产物浓度高、转化率高、转化时间短、副产物少，产物易分离，成本低，不仅有效的拓展了D-阿洛酮糖的生产方法，还可用于D-阿洛酮糖的大规模生产。
附图说明
[0017]图1：重组质粒pETDuet-1-MCSⅡadh构建图。
阿洛酮糖（1）先提前利用重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet-1-MCSⅡadh进行转化阿洛醇为D-阿洛酮糖的有效性验证：按照1%的接种量将重组菌株E. coli BL21 star (DE3)-pETDuet-1-MCSⅡadh接种于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LBG液体培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L氯化钠和5 g/L葡萄糖）中，37 ℃，200 rpm培养3 h，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2 mM，并将温度降低到20 ℃，转速降低至100 rpm，继续培养12 h；培养结束后，菌液10000 rpm离心5 min收集菌体，并用pH 10.0，20 mM 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因连接到载体质粒上，得到重组质粒；（2）将重组质粒转化到大肠杆菌中，得到重组菌株；（3）将重组菌株接种到含有氨苄青霉素的培养基中培养后，在诱导剂的作用下，于低温诱导培养；培养结束后离心收集菌体，菌体经缓冲液重复洗涤后，使用阿洛醇溶液重悬菌体，重悬的菌体再经摇床培养后离心取上清液，上清液煮沸后经超高速离心或超滤，所得的清液中即含有D-阿洛酮糖。2.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的NAD(P)-依赖型醇脱氢酶基因具有下列核苷酸序列之一：（1）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；（2）与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化条件为：将重组质粒以1：10的体积比加入表达感受态细胞中，冰浴后热击，再立即冰浴，而后加入LB液体培养基中复苏，再将菌液涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板上，静置培养过夜；再挑取单菌落转接至LB液体培养基中，并添加氨苄青霉素，37℃摇床培养后得到重组菌株。4.根据权利要求1所述的一种利用含有NAD(P)-依赖型醇脱氢酶的菌株催化生产D-阿洛酮糖的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建强，温鑫，宋欣，任一林，林建群，
申请(专利权)人：青岛龙鼎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：