产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用。本发明专利技术提供了产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建方法，本发明专利技术通过敲除大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖的转运降解途径提高大肠杆菌积累N-乙酰氨基葡萄糖能力；弱化糖酵解途径对N-乙酰氨基葡萄糖合成前体果糖-6-磷酸的利用，从而提高N-乙酰氨基葡萄糖合成前提物质供应；进一步通过对大肠杆菌无机氨摄取系统的改造并过表达谷氨酰胺合酶提高N-乙酰氨基葡萄糖合成途径辅因子的供应进一步提高的大肠杆菌产物合成水平。通过对高密度发酵和全细胞转化工艺的优化，使N-乙酰氨基葡萄糖合成达到112/L，高于目前国内文献报道水平。高于目前国内文献报道水平。

【技术实现步骤摘要】
产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的构建与应用。

技术介绍

[0002]N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以及其脱乙酰衍生物氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)存在于所有的生命体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物和动物均可合成。在人类中，N-乙酰氨基葡萄糖是透明质酸、硫酸软骨素等物质的前体，是保持和修复软骨和关节健康的必备物质。临床研究表明，服用N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖对于治疗关节炎具有良好的作用。因此N-乙酰氨基葡萄糖作为药物和营养膳食广泛的应用于关节损伤的治疗和修复。目前，N-乙酰氨基葡萄糖主要是通过水解虾壳蟹壳中的几丁质获得的，生产过程中会产生严重的污染，另一方面，通过此方法制备的N-乙酰氨基葡萄糖易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏人群服用。

技术实现思路

[0003]为了制备N-乙酰氨基葡萄糖，本专利技术提供了如下技术方案：
[0004]本专利技术的一个目的是提供一种产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建方法。
[0005]本专利技术提供的构建方法，包括如下步骤：使突变型大肠杆菌或大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶，得到产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌；
[0006]所述突变型大肠杆菌为将所述大肠杆菌按照如下A1和/或A2改造：
[0007]A1、弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌；
[0008]A2、解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制；
[0009]上述方法中，所述使突变型大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶为将6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶(氨基酸序列为序列2，编码基因的核苷酸序列为序列1)导入所述突变型大肠杆菌；
[0010]所述弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌为抑制或降低所述大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性；
[0011]或，所述解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制为抑制或降低所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnE和/或glnB的表达或活性。
[0012]上述方法中，所述抑制或降低大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因；
[0013]或，所述抑制或降低大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnE的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因，或，将所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因替换为带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS；
[0014]或，所述抑制或降低所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnB的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnB。
VB1 1ml/L、葡萄糖10g/L、MgSO40.3g/L，得到高密度发酵培养基。
[0034]本专利技术通过敲除大肠杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖的转运降解途径提高大肠杆菌积累N-乙酰氨基葡萄糖能力；弱化糖酵解途径对N-乙酰氨基葡萄糖合成前体果糖-6-磷酸的利用，从而提高N-乙酰氨基葡萄糖合成前提物质供应；进一步通过对大肠杆菌无机氨摄取系统的改造并过表达谷氨酰胺合酶提高N-乙酰氨基葡萄糖合成途径辅因子的供应进一步提高的大肠杆菌产物合成水平。通过对高密度发酵和全细胞转化工艺的优化，使N-乙酰氨基葡萄糖合成达到112/L，高于目前国内合成N-乙酰氨基葡萄糖的产量。
附图说明
[0035]图1为工程菌产GlcNAc的结果。
[0036]图2为工程菌GNA1/GN304发酵产GlcNAc。
具体实施方式
[0037]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039]实施例1、构建产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌
[0040]一、构建6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶GNA1表达质粒pYB1a-GNA1
[0041]表达质粒pYB1a-GNA1为将gna1基因(序列1)替换pYB1a-GFP质粒中的GFP基因所得质粒，命名为pYB1a-GNA1；具体构建方法如下：
[0042]根据酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶(GNA1)的氨基酸序列(GenBank:NP_116637.1)，依据大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，全基因合成优化后的序列，6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶编码基因的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。以序列1所示的6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶编码基因为模板，引物(P1和P2)进行扩增，得到6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶(gna1)编码基因扩增产物，片段大小约500bp，与目的片段相符。
[0043]P1:TTTGGTAGGCCGTCTGAGTAGAGCTCCGACGGCGCGCCGTGGTCCG
[0044]P2:TTTACGTCTAAGCATTTATTTCTAGACCATGATCACCACTTAAGCC
[0045]pYB1a是由pBADhisB载体(购自invitrogen公司)改造而来，复制起始位点(1984-2657bp)换成RSF复制起始位点片段(序列如序列5所示)。
[0046]将载体pYB1a使用XhoI和BglII双酶切，电泳回收3500bp片段，使用Gibson连接方法，将酶切回收后的pYB1a和上述gna1扩增产物以一定比例加入Gibson反应体系中。50℃反应1小时。取5μL连接产物转化DH5α(购自Takara，产品目录号为D9057A)，使用氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆的质粒，进行酶切验证，XhoI和BglII双酶切，得到500bp目的片段为阳性质粒，命名为pYB1a-GNA1。
[0047]二、敲除大肠杆菌N-乙酰氨基葡萄糖转运降解途径的基因簇nagEBACD构建大肠杆菌突变体ΔnagEBACD
[0048]大肠杆菌突变体ΔnagEBACD为敲除大肠杆菌BW25113基因组中N-乙酰氨基葡萄糖GlcANc转运降解途径相关基因簇nagEBACD(nagE geneID：945292、nagB geneID：945290nagA geneID：945289nagC geneID：945285nagD geneID：945283；更新日期
20190601)，其他基因不变，得到的重组菌。
[0049]具体方法如下：
[0050]大肠杆菌BW25113(公众可从中国科学院微生物研究所获得，记载过该材料的非专利文献是：Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba,Kirill A Datsenko,Masaru Tomita,Barry L Wanner本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的构建方法，包括如下步骤：使突变型大肠杆菌或大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶，得到产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌；所述突变型大肠杆菌为将所述大肠杆菌按照如下A1和/或A2改造：A1、弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌；A2、解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使突变型大肠杆菌表达6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶为将6-磷酸-氨基葡萄糖乙酰基转移酶导入所述突变型大肠杆菌；所述弱化所述大肠杆菌糖酵解途径得到的突变型大肠杆菌为抑制或降低所述大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性；或，所述解除所述大肠杆菌中对谷氨酰胺合成酶的负反馈抑制为抑制或降低所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnE和/或glnB的表达或活性。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低大肠杆菌中丙酮酸激酶编码基因的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因；或，所述抑制或降低大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnE的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因，或，将所述大肠杆菌中的丙酮酸激酶编码基因替换为带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS；或，所述抑制或降低所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnB的表达或活性为敲除所述大肠杆菌中氮同化调节蛋白编码基因glnB。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述带有启动子的谷氨酰胺合成酶基因CgGS的启动子为CPA1。5.根据权利要求1-4中任一所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：林白雪，王鹏超，张译元，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：