SODsiRNA，结合绿僵菌、白僵菌或拟青霉在白蚁防治中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双链核酸SOD siRNA，采用双链核酸SOD dsRNA通过RNase III消化获得SOD siRNA。一种含双链核酸SOD siRNA的防治白蚁的产品。随后利用RNase III将SOD dsRNA消化成作用效果更强的SOD siRNA。将SOD siRNA与白蚁食物混合，随后放入白蚁群体中供白蚁取食。白蚁取食SOD siRNA后，体内SOD基因表达量显著下降，SOD酶活性显著降低。分别用金龟子绿僵菌、球孢白僵菌和淡紫拟青霉感染取食SOD siRNA的白蚁后，染菌白蚁死亡率均显著上升。这表明SOD siRNA能够显著提高绿僵菌、白僵菌和拟青霉对白蚁的生物防治效果。拟青霉对白蚁的生物防治效果。拟青霉对白蚁的生物防治效果。

【技术实现步骤摘要】
SOD siRNA，结合绿僵菌、白僵菌或拟青霉在白蚁防治中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及SOD基因和SOD siRNA，一种增强生防菌杀灭白蚁效果的双链核酸SOD siRNA。

技术介绍

[0002]白蚁是一种全球性的经济害虫，危害园林树木、农作物、房屋建筑和水库堤坝等，给人类的生命财产带来巨大威胁。我国每年因白蚁危害造成的经济损失达100亿人民币，因此白蚁防治工作受到高度重视。化学防治是白蚁防治的主要手段。然而，许多高毒高污染化学药剂已被禁用。因此，研究和开发无毒、无污染、对环境友好的新型生物防治药剂成为白蚁防治领域的迫切需求之一。
[0003]在自然界，由真菌致死的昆虫约占全部病原微生物致病导致死亡的60%。利用昆虫专性致病真菌能够有效控制有害昆虫种群数量，因而得到广泛研究和应用。目前，绿僵菌（Metarhizium）、白僵菌（Beauveria）和拟青霉（Paecilomyces）在绿色防控技术中，是最成功、最经济、最广泛、最安全的生防制剂。其寄主昆虫包括鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、双翅目、半翅目等有害昆虫。这些昆虫专性致病真菌能够附着于昆虫表皮，在合适的温度下，萌发，产生芽管，并形成侵入钉。随后分泌几丁质酶，溶解昆虫体壁，进入昆虫体腔，侵入昆虫的脂肪组织和肌肉。最后在昆虫体内繁殖，掠夺营养，产生毒素，进而导致昆虫死亡。然而，利用虫生真菌防治野外白蚁巢群的效果很不理想，这是由于白蚁属于社会性昆虫，其巢内成员依赖社会免疫体系，在行为和生理防御上进化出一系列疾病防御策略（例如理毛、体表消毒、“接种”、免疫反应、解毒和抗氧化反应等）。因此，如何削弱白蚁疾病防御力是提高生防菌杀灭白蚁效果的关键。
[0004]染菌白蚁在抵御体内真菌侵染和分解真菌毒素的过程中，会产生大量超氧阴离子自由基，而过量超氧阴离子自由基能够损伤细胞膜，使蛋白质变性，破坏DNA结构等。超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，广泛分布于微生物、植物和动物体内，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，保护机体免受氧化损伤。前期研究表明，染菌白蚁体内SOD基因表达和SOD酶活性显著升高，表明SOD在白蚁抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用。因此，本专利技术拟以白蚁SOD基因为靶标基因，通过喂食白蚁SOD siRNA沉默SOD基因，削弱白蚁SOD酶的抗氧化活性，从而提高生防菌对白蚁的杀灭效果。
[0005]目前，RNAi结合生防菌协同防治有害昆虫（例如鳞翅目、同翅目和蜚蠊目等有害昆虫）的方法受到研究者的广泛关注。然而，在白蚁防治中，大部分RNAi农药停留在分子较大、效率较低的dsRNA上，造成白蚁RNAi成本高、效率低，制约白蚁RNAi农药的发展。此外，几乎所有白蚁生防菌研究主要集中在金龟子绿僵菌上，关于RNAi协同其他生防菌的研究较少。鉴于此，本专利技术拟在dsRNA的基础上，将其消化成更小，更易被吸收，干扰效率更高的siRNA。同时，除了绿僵菌，本专利技术还拟在其他生防菌效果上寻求突破。结果表明，本专利技术SOD siRNA比SOD dsRNA具有更高的干扰效率。同时SOD siRNA具有较为广泛的增效作用，对绿僵菌、白
僵菌和拟青霉均具有增效作用。其中，SOD siRNA结合白僵菌具有更高的致死白蚁效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供靶标基因SOD以及SOD siRNA在白蚁生物防治中的应用：通过削弱白蚁抗氧化能力提高生防菌的杀虫效果。
[0007]本专利技术SOD siRNA的设计来源于白蚁体内一种关键抗氧化基因，超氧化物歧化酶基因（SOD），DNA序列来源于黑胸散白蚁转录组数据库，为SEQ 1。通过SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：2和下游引物SEQ ID NO：3，以白蚁cDNA为模板进行PCR扩增、TA克隆或者平末端克隆、挑菌检测和质粒回收，获得含有目的基因SOD片段的纯净质粒，含有目的基因SOD片段长度为648 bp，DNA序列如SEQ ID NO：4所示。
[0008]通过SEQ ID NO：4设计含“转录增强子”和“T7启动子”的特异性引物，上游引物为SEQ ID NO：5，下游引物为SEQ ID NO：6，以含有目的基因SOD片段的纯净质粒为模板进行PCR扩增，通过醋酸钠结合无水乙醇的方法浓缩SOD dsRNA模板，模板长度581 bp，DNA序列如SEQ ID NO：7所示。
[0009]SOD dsRNA模板通过体外转录系统获得SOD dsRNA，通过醋酸钠结合无水乙醇的方法浓缩SOD dsRNA，产物长度529 bp，RNA序列如SEQ ID NO：8所示。
[0010]SOD dsRNA通过RNase III消化得到SOD siRNA。
[0011]基于上述基因序列和方法，本专利技术还提供一种含双链核酸SOD siRNA的防治白蚁的产品。
[0012]一种含双链核酸SOD siRNA为活性成分的防治白蚁的产品。
[0013]双链核酸SOD siRNA协同生防菌制备得到的防治白蚁的产品，所述的生防真菌包括绿僵菌、白僵菌或拟青霉中的一种或多种。
[0014]一种防治白蚁的方法，包含所述的双链核酸SOD siRNA，步骤如下：（1）将双链核酸SOD siRNA与白蚁食物混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，得到取食SOD siRNA的白蚁；（2）利用质量浓度是0.1
‑
2 % Tween 80溶液收集生防真菌孢子，制备生防菌孢子悬浮液；（3）利用生防真菌孢子悬浮液感染取食SOD siRNA的白蚁，进而防治白蚁。
[0015]白蚁食物包括纸片、木块、木屑、或木粉的含纤维素的物质，SOD siRNA与白蚁食物混合方式为浸润、涂抹、或注入的混合方法。
[0016]所述的生防菌包括绿僵菌、白僵菌、或拟青霉中的一种或多种。
[0017]本专利技术通过上述合成的SOD siRNA对黑胸散白蚁的干扰效果进行监测：将含有SOD siRNA或GFP siRNA的溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养白蚁的培养皿中供白蚁取食。取食1 d后，对培养皿中白蚁进行RT
‑
qPCR检测。取食SOD siRNA的白蚁为处理组，取食等量GFP siRNA的白蚁为对照组。结果表明，与对照组比较，取食1 d SOD siRNA的处理组白蚁体内SOD基因表达量显著降低。
[0018]本专利技术通过上述合成的SOD siRNA对黒胸散白蚁体内酶活的抑制效果进行检测：将SOD siRNA溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养白蚁的培养皿中供白蚁取食。取食1 d后，作为处理组；将等量GFP siRNA溶液浸湿滤纸片，随后放入饲养白蚁的培养皿中供白蚁取食。取
食1 d后，作为对照组。放入液氮中进行研磨，离心取上清液。利用SOD酶活试剂盒检测发现，与对照组比较，取食SOD siRNA的染菌白蚁体内SOD酶活性显著降低。
[0019]本专利技术通过上述合成的SOD siRNA对3种生防菌的增效作用进行检测：将SOD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SOD基因，即超氧化物歧化酶基因，其特征在于，SOD 的DNA序列来源于黑胸散白蚁转录组数据库，DNA序列为SEQ ID NO：1。2.一种质粒，包含SOD基因片段的质粒，其特征在于，DNA序列为SEQ ID NO：4。3.一种SOD dsRNA模板，其特征在于，SOD dsRNA模板的DNA序列为SEQ ID NO：7。4.一种双链核酸SOD dsRNA，其特征在于，双链核酸SOD dsRNA，RNA序列为SEQ ID NO：8。5.一种双链核酸SOD siRNA，其特征在于，采用权利要求4所述的双链核酸SOD dsRNA通过RNase III消化获得SOD siRNA。6.一种含双链核酸SOD siRNA的防治白蚁的产品。7.一种含权利要求6所述的双链核酸SOD siRNA为活性成分的防治白蚁的产品。8.权利要求7所述的产品，其特征在于，双链核酸SOD siRN...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，汤清波，闫凤鸣，白润娥，张鑫，孙鹏东，万历，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：