一种合成P34HB的菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种合成P34HB的菌株及其构建方法和应用。包括如下步骤：S1：体外扩增ppdA

【技术实现步骤摘要】
NO.61850。
[0009]其中，ppdA
‑
C
‑
B基因序列如SEQ ID NO.1所示，dhaT
‑
aldD基因序列如SEQ ID NO.2所示，orfZ基因序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]本申请中使用的Halomonas lutescens MDF
‑
9菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC地址:广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为GDMCC NO：61850。菌株名称为MDF
‑
9，分类命名为盐单胞菌(Halomonas lutescens)。
[0011]本申请的Halomonas lutescens MDF
‑
9菌株已经在在先申请中公开，申请号为202110929333.2，专利技术名称为“一株盐单胞菌及其应用”。
[0012]进一步的，所述步骤S1中目的基因ppdA
‑
C
‑
B和所述步骤S2中目的基因dhaT
‑
aldD
‑
orfZ的扩增体系为：
[0013][0014]进一步的，所述步骤S1中目的基因ppdA
‑
C
‑
B和所述步骤S2中目的基因dhaT
‑
aldD
‑
orfZ的扩增程序为：
[0015][0016]进一步的，所述步骤S1中通过PCR得到ppdA
‑
C
‑
B基因片段，将ppdA
‑
C
‑
B基因片段通过酶切连接插入pET
‑
28a(+)载体中，得到所述第一载体质粒。
[0017]进一步的，所述步骤S2中通过PCR得到dhaT
‑
aldD
‑
orfZ基因片段，将dhaT
‑
aldD
‑
orfZ基因片段通过酶切连接插入pACYCDuet
‑
1载体中，得到所述第二载体质粒。
[0018]进一步的，所述酶切体系为：
[0019][0020]本专利技术还提供一种合成P34HB的工程菌株，由所述的构建方法得到。
[0021]本专利技术还提供一种使用所述的工程菌株生产P34HB的方法，包括如下步骤：
[0022](1)平板种子培养：菌种活化；
[0023](2)摇瓶种子培养；
[0024](3)溶氧和pH电极校正；
[0025](4)发酵参数的设定；
[0026](5)接种；
[0027](6)发酵过程控制；
[0028](7)菌体中PHA的提取。
[0029]进一步的，所述步骤(6)中控制发酵罐温度36～38℃。
[0030]进一步的，所述步骤(6)中控制pH为7.5～9.5，优选为8.2～8.5。
[0031]综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
[0032]1.本专利技术使用外源添加的1,2,4
‑
丁三醇作为前体化合物，具有环保无污染、价格低、易获得、生产安全系数高的优势。
[0033]2.本专利技术中P4HB聚酯可以由生物发酵制得，能够降低生产成本、且安全无毒。
[0034]3.本专利技术使用嗜盐单胞菌MDF
‑
9为底盘生物，发酵过程为高盐高碱，因此发酵过程不需要灭菌，操作更加方便，可实现连续接种或补充底物进行不间断发酵，与使用埃希氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属的菌株相比更加节省能源。
附图说明
[0035]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0036]图1为本专利技术的工程菌进行的生产4HB的代谢过程。
[0037]图2为本专利技术构建中使用的第一载体pET
‑
28a(+)结构图。
[0038]图3为本专利技术构建中使用的第二载体pACYCDuet
‑
1结构图。
[0039]图4为本专利技术实施例1制备得到的工程菌的PCR验证结果(ppdA
‑
C
‑
B)。
[0040]图5为本专利技术实施例2制备得到的工程菌的PCR验证结果(dhaT
‑
aldD
‑
orfZ)。
具体实施方式
[0041]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的
附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。
[0042]本专利技术中ppdA
‑
C
‑
B基因的作用是将1,2,4
‑
丁三醇转化为4
‑
羟基丁醛，YqhD基因的作用是将4
‑
羟基丁醛转化为1,4
‑
丁二醇，YqhD基因是MDF
‑
9菌株中人为转入的；dhaT
‑
aldD
‑
orfZ基因的作用是将1,4
‑
丁二醇转化为4
‑
羟基丁酸(简称4HB)，orfZ基因的作用是将4
‑
羟基丁酸转化为4
‑
羟基丁酰辅酶A，进而生成P4HB。在MDF
‑
9菌株特有的酶PHA聚合酶(基因为phaC)作用下合成聚(3
‑
羟基脂肪酸酯
‑
CO
‑4‑
羟基脂肪酸酯)(简称P3HB)。因MDF
‑
9本身具有生产聚3
‑
羟基脂肪酸酯(P3HB)的代谢途径，本专利技术主要是在此基础上新增一条生产P4HB的代谢途径(如图1所示)。菌株构建成功后可达到生产3HB、4HB共聚物(简称P34HB)的目的。
[0043]本专利技术的流程如下：
[0044]1.分别体外扩增ppdA
‑
C
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B基因片段和dhaT
‑
aldD
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orfZ基因片段；
[0045]2.ppdA
‑
C
‑
B与载体质粒pET
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28a(+)结合形成新的质粒pETppdA
‑
C
‑
B；dhaT
‑
aldD
‑
orfZ与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成P34HB的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：体外扩增ppdA
‑
C
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B目的基因序列，将所述ppdA
‑
C
‑
B目的基因序列插入第一载体中，得到第一载体质粒；S2：体外扩增dhaT
‑
aldD
‑
orfZ目的基因序列，将所述dhaT
‑
aldD
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orfZ目的基因序列插入第二载体中，得到第二载体质粒；S3：将S1得到的第一载体质粒和S2得到的第二载体质粒共同转入Halomonas lutescens MDF
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9感受态细胞中；所述Halomonas lutescens MDF
‑
9的保藏编号为GDMCC NO.61850。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中目的基因ppdA
‑
C
‑
B和所述步骤S2中目的基因dhaT
‑
aldD
‑
orfZ的扩增体系为：3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中目的基因ppdA
‑
C
‑
B和所述步骤S2中目的基因dhaT
‑
aldD
‑
or...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈宏伟，张巧巧，吕金艳，骆颢元，孙磊，田道贺，张恒文，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：