一种提高减毒绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种提高减毒绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用，从减毒李斯特菌LIΔactAplcB出发，构建了敲除dal、dat基因的LIΔactAplcBdaldat减毒菌株，同时构建携带dal基因的回补质粒pCW633，并将其电转入减毒营养缺失株LIΔactAplcBdaldat中，构建稳定的重组菌株LIΔactAplcBdaldat::pCW633。与野生株LI相比，重组菌株LIΔactAplcBdaldat::pCW633分泌MVs产量可提高1.84倍，且重组菌分泌的MVs的形状结构、粒径尺寸和蛋白组分与野生株分泌的MVs无明显差别。MVs无明显差别。MVs无明显差别。

【技术实现步骤摘要】
一种提高减毒绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种提高减毒绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用。

技术介绍

[0002]细菌细胞外囊泡(Bacterial membrane vesicles,BMVs)是由细菌在生长过程中释放至胞外环境的一种脂质双层膜纳米结构，其直径介于20
‑
200nm之间，其上含有多种菌体成分，包括脂质、蛋白、核酸等，可以介导细菌
‑
细菌、细菌
‑
宿主的相互作用，参与细菌致病、信号传递、群体感应、压力应激等多种生物学活动。BMVs依据来源菌的革兰染色特性可分为革兰阴性菌(Gram
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negative bacteria,G
‑
)分泌的外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)与革兰阳性菌(Gram
‑
positive bacteria,G
+
)分泌的膜囊泡(Membrane vesicles,MVs)，这两种BMVs的分泌机制有所不同，结构组分因来源细菌的细胞壁结构与组成成分的不同也存在较大差别。BMVs上复杂多样的组分使其具有良好的免疫原性，可有效刺激机体产生免疫应答。而囊状结构又赋予其携带外源抗原与包载小分子药物的能力，因此，BMVs被认为是一种有前景的疫苗载体平台或药物递送系统。已获上市的B群脑膜炎疫苗MenBvac就是基于脑膜炎奈瑟球菌OMVs研发，这也证明BMVs具有广阔的应用前景。
[0003]目前，有关BMVs的研究多集中在G
‑
菌分泌的OMVs上，包括大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等分泌的OMVs。但值得注意的是，OMVs含有G
‑
菌细胞壁特有组分——内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，这种致热原的存在使得以OMVs为基础的生物制剂在的安全性值得质疑，这也在一定程度上限制了OMVs的应用。而G
+
菌产生的MVs不含有内毒素LPS，安全性更好。因此，以G
+
菌MVs为基础研发的生物制剂相较于OMVs而言，更具优势。但目前基于MVs的研究相对较少，仅金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等少数G
+
菌有见报道，主要限制因素在于G
+
菌MVs的产量相对较低。而MVs的分泌与细菌细胞壁肽聚糖层的交联程度有关。
[0004]李斯特菌属(Listeria)是一类G
+
无芽胞短杆菌,胞内寄生，目前已发现多个菌种，常见包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LI)与绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)。LM、LI可产生内化素、溶血素等多种毒力因子，促进吞噬与逃逸溶酶体，可同时激起机体细胞与体液免疫应答。LI产生的MVs与其他MVs相似，具有良好生物安全性、较高的免疫原性，可负载外源抗原等优点，但同样存在产量较低的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提高减毒绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种提高绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法，具体步骤如下：
[0008](1)敲除绵羊李斯特菌减毒株LIΔactAplcB的dal、dat基因，获得菌株LIΔ
BHI肉汤中，于37℃，200rpm摇育16小时；调节菌液OD600值至1.0，取菌液按体积比1:100接种至BHI肉汤中，于37℃，200rpm摇育16小时。
[0020]作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，离心的工艺条件为：4℃，12000g离心10分钟。
[0021]作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，提取纯化的具体方法如下：
[0022](3
‑
a)将上清过0.22μm滤膜，超滤浓缩，超高速离心取沉淀，0.01mol/L PBS(pH7.2)重悬，得到粗提产物；
[0023](3
‑
b)将粗提产物利用多层不同浓度的碘克沙醇溶液进行超高速离心处理，分层收集，合并无鞭毛的液层，0.01mol/L PBS(pH7.2)补足体积，再次超高速离心取沉淀，0.01mol/LPBS(pH7.2)重悬，即得。
[0024]作为进一步优选的技术方案之一，步骤(3
‑
a)中，超滤浓缩的截留分子量为500kDa，超高速离心的工艺条件为：4℃，140000g离心6小时。
[0025]作为进一步优选的技术方案之一，步骤(3
‑
b)中，碘克沙醇溶液的质量浓度为45％、35％、30％、25％、20％、15％、10％，从下至上依次铺入离心管中，最上层铺入粗提产物。
[0026]作为进一步优选的技术方案之一，步骤(3
‑
b)中，超高速离心的工艺条件为：4℃，180000g离心4小时；再次超高速离心的工艺条件为：4℃，140000g离心6小时。
[0027]本专利技术还提供了前述方法在减毒LI MVs相关的基础研究中的应用，具体包括在减毒LI MVs多组学研究、潜在生物学功能研究和以减毒LI MVs为载体的制剂制备中的应用。
[0028]本专利技术的有益效果在于：
[0029]为解决减毒绵羊李斯特菌MVs产量较低的问题，本专利技术从减少细菌细胞壁肽聚糖层交联程度的角度出发，增加减毒LI MVs的产量。在细菌细胞壁合成过程中，D
‑
丙氨酸(D
‑
alanine,D
‑
Ala)在肽聚糖层间交联中发挥至关重要的作用。D
‑
Ala的合成与dal、dat基因有关。dal基因控制合成丙氨酸消旋酶(Alanine racemase,Alr)，可将L
‑
丙氨酸转化为D
‑
Ala，而dat基因控制合成D
‑
丙氨酸转氨酶(D
‑
amino acid aminotransferase,D
‑
AAT)，可通过转氨作用将D
‑
谷氨酸与丙酮酸生成D
‑
Ala与α
‑
酮戊二酸。当敲除细菌基因组上dal、dat基因时，细菌无法形成细胞壁，在无外源D
‑
Ala添加的培养基中无法生长。因此本专利技术在质粒上加入dal基因，回补入dal、dat缺失株中，即可在维持细菌生长的前提下，尽可能减少细菌细胞壁中肽聚糖层的交联程度，从而达到增加MVs产量的目的。目前尚无涉及与dal、dat基因有关的MVs产量提高方法，因此本专利技术具有首创性。
[0030]本专利技术从减毒李斯特菌LIΔactAplcB出发，构建了敲除dal、dat基因的LIΔactAplcBdaldat减毒菌株，同时构建携带dal基因的回补质粒pCW633本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高绵羊李斯特菌膜囊泡产量的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)敲除绵羊李斯特菌减毒株LIΔactAplcB的dal、dat基因，获得菌株LIΔactAplcBdaldat，并制备LIΔactAplcBdaldat感受态细胞；(2)将打靶质粒pCW633电转入LIΔactAplcBdaldat感受态细胞中，得到菌株LIΔactAplcBdaldat::pCW633；(3)培养LIΔactAplcBdaldat::pCW633，离心取上清，提取纯化得到减毒绵羊李斯特菌膜囊泡LI MVs。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法如下：(1
‑
1)绵羊李斯特菌减毒株LIΔactAplcB制备得到感受态LIΔactAplcB，将打靶质粒pCW619
‑
LIdal电转入LIΔactAplcB感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.1所示的引物pCW619
‑
LIdal
‑
F和SEQ ID NO.2所示的引物pCW619
‑
R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.3所示的引物LIdal
‑
F、SEQ ID NO.4所示的引物LIdal
‑
R、SEQ ID NO.5所示的引物HomoLIdal
‑
F、SEQ ID NO.6所示的引物HomoLIdal
‑
R进行菌落PCR筛选，得到菌株LIΔactAplcBdal，制备LIΔactAplcBdal感受态细胞；(1
‑
2)将打靶质粒pCW619
‑
LIdat电转入LIΔactAplcBdal感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.7所示的引物pCW619
‑
LIdat
‑
F、SEQ ID NO.2所示的引物pCW619
‑
R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.8所示的引物LIdat
‑
F、SEQ ID NO.9所示的引物LIdat
‑
R、SEQ ID NO.10所示的引物HomoLIdat
‑
F、SEQ ID NO.11所示的引物HomoLIdat
‑
R进行菌落PCR筛选，得到菌株LIΔactAplcBdaldat，制备LIΔactAplcBdaldat感受态细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1
‑
1)中，打靶质粒pCW619
‑
LIdal的制备方法如下：将pCW619
‑
LIdal大肠杆菌菌种划线接种至添加100μg/mL氨苄西林的LB固体培养基，于37℃培养16小时；挑取单菌落接种至添加100μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇育16小时，提取质粒pCW619
‑
LIdal。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，菌株LIΔactAplcBdaldat::pCW633的制备方法如下：将打靶质粒pCW633电转入LIΔactAplcBdaldat感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.22所示的引物asd
‑
SX
‑
F、SEQ ID NO.23所示的引物asd
‑
SX
‑
R进...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪川，唐明圆，雷瑶，陈科翰，田思成，张秋阳，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：