本发明专利技术涉及生物技术领域,特别涉及重组卡介苗菌株构建及其应用,本发明专利技术通过对野生型BCG菌株Pasteur1173P2进行改良,敲除野生型BCG菌株的bcg_0819c基因,构建BCG重组疫苗,经小鼠实验验证敲除bcg_0819c基因后的BCG菌株在小鼠肺部的定植能力大大增强,可为宿主持续提供更高的免疫原性,使宿主产生更多的抗体以抵抗结核分枝杆菌。该改良的BCG重组疫苗菌株可用于结核病的防控。可用于结核病的防控。可用于结核病的防控。
【技术实现步骤摘要】
一株新型重组卡介苗菌株的构建及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
,特别涉及一株新型重组卡介苗菌株的构建及其应用。
技术介绍
[0002]结核病(Tuberculosis,TB)是一种病变主要发生在肺组织、气管、支气管和胸膜的慢性传染病,是第二大致死性传染病,其主要致病菌为结核分枝杆菌。据统计,世界上约有四分之一的人口感染了结核分枝杆菌,这些人中有5%
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15%会患活动性结核病。据世界卫生组织(WHO)在发布的最新《2022年全球结核病报告》,2021年,全球新发结核病患者1060万。主要分布在发展中国家,我国结核病新发患者数为78万(2020年84.2万),估算结核病发病率为55/10万(2020年59/10万),在30个结核病高负担国家中我国估算结核病发病数排第3位,仅次于印度尼西亚和印度。
[0003]在全球范围内,由于缺乏高效的结核病疫苗和治疗药物,使得结核病的预防和高效控制面临很多障碍。而其他相关疾病如HIV与TB的共感染以及多重耐药菌株的出现使得该情形变的更加紧急和复杂。因此,急需开发安全且高效的抗结核病新型疫苗,从源头上抵抗结核分枝杆菌,可以大大减少结核病的新发病例。
[0004]卡介苗(Mycobacterium bovis BCG,BCG)是牛分枝杆菌减毒活菌家族的总称,是由牛结核分枝杆菌经过连续体外传代得到的减毒型菌株,由其悬浮液所制成的活菌疫苗,是目前唯一获批准用于人类结核病防控的疫苗,各国的疫苗接种建议情况各不相同。该疫苗具有增强巨噬细胞活性,加强巨噬细胞杀灭肿瘤细胞的能力,活化T淋巴细胞,增强机体细胞免疫的功能。卡介苗对新生儿和老年人的非结核感染具有非特异性益处,并对某些恶性肿瘤提供免疫治疗益处。
[0005]目前卡介苗BCG在幼儿时期接种并且只能在有限的时间内产生一定的保护作用,所以开发新型高效的抗结核病疫苗有助于对机体进行长时间持续的保护作用。开发抗结核疫苗的方法除了对卡介苗重新配制之外,还有三种不同的疫苗开发方法:1.开发全新的结核病疫苗;2.从现有卡介苗衍生出的新型重组疫苗;3.开发加强疫苗接种以加强现有的卡介苗疫苗接种。然而,最为安全的是对现有疫苗进行改造,衍生出新型重组疫苗。目前,有四种重组卡介苗疫苗正在研究中,以取代亲本卡介苗。第一种是BCG
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Zmp1,仍处于临床前阶段的疫苗。BCG
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Zmp1疫苗是一种减毒的BCG疫苗,具有zmp1基因的敲除突变,该基因编码锌金属蛋白酶Zmp1,与的传统BCG疫苗接种相比,BCG
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Zmp1疫苗具有高免疫原性和更高的安全性,因此对结核分枝杆菌具有更好的保护作用。临床试验的第二种候选疫苗是SapM:TnBCG,它来自亲本牛分枝杆菌卡介苗菌株的sapM基因的插入突变。与亲本BCG相比,接种SapM:TnBCG的小鼠表现出更强大的免疫反应。第三种临床候选疫苗是CysVac2,这是一种表达融合蛋白的重组卡介苗,融合蛋白包含抗原Ag85B和一个在结核分枝杆菌持续感染期间表达的蛋白CysD。小鼠接种CysVac2疫苗的注射部位引起先天免疫细胞的大量涌入,特别是中性粒细胞、巨噬细胞。最后一个是VPM1002疫苗,是一种用单核细胞增生性李斯特菌的溶血素编码基因(hly)替代卡介苗中脲酶C基因的重组卡介苗疫苗菌株。与BCG对照组相比,
VPM1002疫苗接种具有显着的保护效果,Th1反应显著,细菌负荷降低。目前正在印度进行VPM1002疫苗接种的III期试验。目前的BCG疫苗菌株的免疫原性不足以在宿主中诱导足够的保护作用,基因工程改造的BCG株具有较强的免疫原性并能够刺激产生更多的抗体以抵抗病原菌。本专利技术描述了一种新策略以改善现有BCG疫苗株的定植能力与免疫原性。
技术实现思路
[0006]鉴于上述内容,有必要提供一株新型重组卡介苗菌株的构建及其应用,本专利技术发现通过在野生型BCG菌株Pasteur 1173P2上敲除bcg_0819c基因构建的BCG重组疫苗菌株以提高其免疫原性,并将其应用于新型抗结核疫苗。基于此,本专利技术提供了一种构建bcg_0819c基因缺失的BCG重组疫苗菌株的制备方法,以及bcg_0819c基因缺失的BCG重组疫苗菌株在抗结核疫苗的应用。
[0007]为达到上述目的,本专利技术所采用的技术方案是:
[0008]一株新型重组卡介苗菌株,所述菌株由野生型BCG菌株Pasteur 1173P2敲除bcg_0819c基因获得,所述bcg_0819c基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本申请的野生菌株Pasteur1173P2全称为:Mycobacterium tuberculosis variant bovis BCG Pasteur 1173P2,受赠于ATCC,其是公知公用菌株,可在上海晶诺生物科技有限公司购买,全基因组序列已被NCBI公开,登录号为NC_008769.1。
[0009]本专利技术包括一株新型重组卡介苗菌株的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
[0010](1)以Pasteur 1173P2菌株为模板,以bcg_0819c
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up
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PacI
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F/bcg_0819c
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up
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SpeI
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R引物对扩增出bcg_0819c基因上游1000bp片段;所述bcg_0819c
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up
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PacI
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F引物序列如SEQ ID NO:2所示,所述bcg_0819c
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up
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SpeI
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R引物序列如SEQ ID NO:3所示;所述bcg_0819c基因上游1000bp片段序列如SEQ ID NO:4所示;
[0011](2)以Pasteur 1173P2菌株为模板,以bcg_0819c
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dn
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HindIII
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F/BCG_0819c
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dn
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NheI
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R引物对扩增出bcg_0819c基因下游1000bp片段;所述bcg_0819c
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dn
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HindIII
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F引物序列如SEQ ID NO:5所示,所述bcg_0819c
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dn
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NheI
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R引物序列如SEQ ID NO:6所示;所述bcg_0819c基因上游1000bp片段序列如SEQ ID NO:7所示;
[0012](3)对bcg_0819c基因上游1000bp片段和下游1000bp片段分别采用对应的限制性内切酶进行酶切,回收纯化后的基因片段;所述bcg_0819c基因上游1000bp片段的限制性内切酶为PacI和SpeI;所述bcg_0819c基因下游1000bp片段的限制性内切酶为H本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株新型重组卡介苗菌株其特征在于,由野生型BCG菌株Pasteur1173P2敲除bcg_0819c基因获得,所述bcg_0819c基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。2.一种构建如权利要求1所述一株新型重组卡介苗菌株的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)以Pasteur1173P2菌株为模板,以bcg_0819c
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up
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PacI
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F/bcg_0819c
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up
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SpeI
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R引物对扩增出bcg_0819c基因上游1000bp片段;所述bcg_0819c
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up
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PacI
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F引物序列如SEQ ID NO:2所示,所述bcg_0819c
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up
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SpeI
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R引物序列如SEQ ID NO:3所示;所述bcg_0819c基因上游1000bp片段序列如SEQ ID NO:4所示;(2)以Pasteur1173P2菌株为模板,以bcg_0819c
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dn
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HindIII
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F/bcg_0819c
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dn
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NheI
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R引物对扩增出bcg_0819c基因下游1000bp片段;所述bcg_0819c
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HindIII
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F引物序列如SEQ ID NO:5所示,所述bcg_0819c
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dn
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NheI
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R引物序列如SEQ ID NO:6所示;所述bcg_0819c基...
【专利技术属性】
技术研发人员:李伟辉,王坤,崔旭杰,郑家琛,刘璐,粟智,
申请(专利权)人:广西大学,
类型:发明
国别省市:
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