一种高产L-异亮氨酸的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产L

【技术实现步骤摘要】
一种高产L
‑
异亮氨酸的基因工程菌及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种高产L
‑
异亮氨酸的基因工程菌及其应用。

技术介绍

[0002]L
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异亮氨酸(L
‑
isoleucine，L
‑
Ile)，又被称为“异白氨酸”，被系统命名为“α
‑
氨基
‑
β
‑
甲基戊酸”，是三大支链氨基酸之一。L
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异亮氨酸的物理性状大多数为白色结晶小片或者是结晶性粉末，其味道无臭但略带有苦味，升华温度为168～170℃，它在食品、医药、化工和饲料领域有广泛应用，随着科技的进步，L
‑
异亮氨酸的需求量在各个领域逐步增加，应用范围同时慢慢扩大。
[0003]目前L
‑
异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，提取法即从蛋白质水解液中分离提取L
‑
异亮氨酸。化学合成法得到的产物通常为四种光学异构体的混合物。要得到天然型L
‑
异亮氨酸，不但需要进行光学拆分，还需分离出L
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别异亮氨酸，工艺繁杂，收率又低。因此，目前工业上很难采用提取法或化学合成法来制造高纯度的L
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异亮氨酸。相比利用蛋白质水解法和化学合成法生产L
‑
异亮氨酸，微生物发酵法在生产过程中绿色环保、成本大大减少、反应易控制以及能适用于大规模的生产，是现在工业上生产L
‑
异亮氨酸的主要方法。
[0004]微生物发酵法合成L
‑
异亮氨酸主要依赖于微生物的发酵作用，所以微生物发酵所选用的微生物种类就显得至关重要。自然条件下能够合成L
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异亮氨酸的菌株主要来源于谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌，大肠杆菌遗传背景清晰、技术操作简单、代时短等优势,被广泛应用于L
‑
苏氨酸、L
‑
色氨酸及L
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苯丙氨酸等氨基酸的生产。因此，可以尝试选育用大肠杆菌产L
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异亮氨酸的菌株并投入工业化生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种高产L
‑
异亮氨酸的基因工程菌及其应用，本专利技术所述的基因工程菌通过切断蛋氨酸和赖氨酸合成代谢途径、切断L
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苏氨酸的分解途径、减弱乙酸合成途径及增加前体物，达到提高L
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异亮氨酸产量的目的，菌株发酵40小时后，L
‑
异亮氨酸产量达到43.22
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44.25g/L。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种高产L
‑
异亮氨酸的基因工程菌，其在蛋氨酸、赖氨酸双重缺陷突变体菌株基因组中敲除了亮氨酸合成途径关键酶基因LeuA、L
‑2‑
氨基
‑3‑
氧代丁酸合成途径关键酶基因tdh、异源基因ybgE、L
‑
苏氨酸脱氢酶基因yiaY、三羧酸循环局部转录因子iclR和全局转录因子ArcA。
[0007]优选的，所述LeuA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述tdh基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述ybgE基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；所述yiaY基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述iclR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述ArcA基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
[0008]优选的，所述蛋氨酸、赖氨酸双重缺陷突变体菌株包括大肠杆菌K12，大肠杆菌K12的出发菌株为大肠杆菌MG1655。
[0009]优选的，所述LeuA、tdh、ybgE、yiaY、iclR和ArcA基因敲除的核苷酸突变片段通过重组PCR获得，扩增LeuA、tdh、ybgE、yiaY、iclR和ArcA核苷酸突变片段的引物序列如SEQ ID No.7
‑
42所示。
[0010]优选的，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除基因。
[0011]本专利技术优选利用ARTP与紫外线(UV)复合诱变的方法构建了大肠杆菌蛋氨酸缺陷型菌株E.coli NXA1和蛋氨酸、赖氨酸双重缺陷菌株E.coli NXA2，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术将所述基因敲除，得到基因工程菌。所述基因工程菌的基因型命名为E.coli K12 MG1655ΔLeuAΔtdhΔybgEΔyiaYΔiclRΔArcA。
[0012]本专利技术对CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术没有特殊限定，本领域技术人员采用常规的将基因敲除即可。
[0013]上述构建方法中，利用基因定点突变试剂盒用于点突变.基因敲除方法为一步法敲除技术，所用的核苷酸突变片段具有敲除基因上下游两个同源臂及卡那霉素抗性基因盒。
[0014]本专利技术还提供了一种应用上述的基因工程菌制备L
‑
异亮氨酸的生产方法，包括以下步骤：
[0015]1)将基因工程菌接种于种子培养基中培养，得到种子液；
[0016]2)将步骤1)中得到的种子液接种于发酵培养基中发酵，得到L
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异亮氨酸。
[0017]优选的，所述步骤1)种子培养基中各组分含量为：硝酸铵2～5g/L、葡萄糖5～10g/L、生物素0.002～0.004g/L、蛋白胨10.5g/L，酵母粉5.5g/L，NaCl10.5 g/L，溶剂为水；pH值为7.0～7.2。
[0018]优选的，所述步骤1)中培养的条件优选为：温度37℃，转速180rpm，时间12h。
[0019]优选的，所述步骤2)发酵培养基中各组分含量为：葡萄糖127.41g/L、硫酸铵32.97g/L、玉米浆15.97g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、硫酸镁2.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01g/L，溶剂为水；pH值为7.0～7.2。
[0020]优选的，所述步骤2)中发酵的条件包括：温度37℃，时间40～50h，转速为200rpm；种子液的接种量优选为10
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15％。
[0021]本专利技术还提供了一种高产L
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异亮氨酸的基因工程菌在制备L
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异亮氨酸中的应用。
[0022]本专利技术所述的一种高产L
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异亮氨酸的基因工程菌及其应用的优点和积极效果是：
[0023]1、本专利技术所述的基因工程菌是利用ARRTP诱变的方法构建了大肠杆菌蛋氨酸缺陷型菌株E.coliNXA1和蛋氨酸、赖氨酸双重缺陷菌株E.coliNXA2，然后将大肠杆菌中的亮氨酸合成途径关键酶基因LeuA、L
‑2‑
氨基
‑3‑
氧代丁酸合成途径关键酶基因tdh、异源基因ybgE表达、L
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苏氨酸脱氢酶基因y本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产L
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异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于：其在蛋氨酸、赖氨酸双重缺陷突变体菌株基因组中敲除了亮氨酸合成途径关键酶基因LeuA、L
‑2‑
氨基
‑3‑
氧代丁酸合成途径关键酶基因tdh、异源基因ybgE、L
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苏氨酸脱氢酶基因yiaY、三羧酸循环局部转录因子iclR和全局转录因子ArcA。2.根据权利要求1所述的一种高产L
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异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述LeuA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述tdh基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述ybgE基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述yiaY基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述iclR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述ArcA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。3.根据权利要求1所述的一种高产L
‑
异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述蛋氨酸、赖氨酸双重缺陷突变体菌株包括大肠杆菌K12，大肠杆菌K12的出发菌株为大肠杆菌MG1655。4.根据权利要求1所述的一种高产L
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异亮氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述LeuA、tdh、ybgE、yiaY、iclR和ArcA基因敲除的核苷酸突变片段通过重组PCR获得，扩增LeuA、tdh、ybgE、yiaY、iclR和ArcA核苷酸突变片段的引物序列如SEQ ID No.7
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42所...

【专利技术属性】
技术研发人员：方海田，刘慧燕，魏晓博，张想军，张皓杰，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：