一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)-柠苹酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)

【技术实现步骤摘要】
一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)
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柠苹酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)
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柠苹酸的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002](R)
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柠苹酸(R
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citramalate)是一种五碳羟基二羧酸，广泛存在于某些细菌的代谢途径当中，例如，詹式甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)、黄杆菌(Chlorobaculum tepidum)中异亮氨酸的生物合成途径；破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum)中谷氨酸的厌氧代谢等，均涉及(R)
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柠苹酸的合成。(R)
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柠苹酸是重要的多功能有机酸，其作为聚合物中间体甲基丙烯酸(MAA)的化学合成前体，不仅可以用于树脂生产工业，而且可以作为酸化剂、除皱剂在食品加工、美容、医疗等领域发挥着重要作用。因此，(R)
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柠苹酸具有广阔的应用和市场前景。
[0003]柠苹酸的合成方法主要为化学法，以氰化氢和乙基乙酰酯为底物通过缩合反应合成。但是，由于前体物质的毒性及其所带来的高成本等问题，难以满足可持续发展的需求，极大限制了该方法的应用。近些年来，随着合成生物学的发展，柠苹酸的生物合成已经成为了更具吸引力的替代方案：以丙酮酸和乙酰
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CoA为前体物质，在柠苹酸合酶的催化下特异性缩合形成柠苹酸。
[0004]2018年，Wu Xianghao等在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达柠苹酸合酶——CimA3.7(该酶来源于詹式甲烷球菌，是由ATSUMI等人经过筛选和定向进化后得到的稳定性更高的酶)，由此成功引入柠苹酸合成途径，得到高产柠苹酸的重组大肠杆菌菌株。该研究以葡萄糖为底物，最终在摇瓶发酵水平产生2.9g/L柠苹酸。虽然大肠杆菌遗传操作简单，但在工业化发酵过程中，其噬菌体侵染的问题仍缺乏有效的解决策略；再者，对于利用重组大肠杆菌生产柠苹酸的过程，由于大肠杆菌对底物葡萄糖的耐受性以及产物积累造成环境pH值降低而导致细胞生长代谢受损的现象，不利于高浓度柠苹酸的积累。
[0005]目前，有关柠苹酸生物生产的研究主要集中于传统发酵法，尚未提出利用全细胞转化这一生产工艺进行产物合成。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)
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柠苹酸的方法，旨在解决现有技术中传统发酵法合成柠苹酸转化率不高、资源浪费等技术问题。
[0007]为达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0008]本专利技术提供了一种可转化生产(R)
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柠苹酸的重组地衣芽孢杆菌，以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICIM B1391为宿主；所述柠苹酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]在一种实施方式中，所述CICIM B1391公开于论文《地衣芽孢杆菌强组成型启动子的鉴定及其表达效果验证》中，申请人承诺自申请日起20年内通过合法途径向公众发放该
菌株。
[0010]在一种实施方式中，所述柠苹酸合酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。
[0011]在一种实施方式中，以质粒pHY
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PLK300为表达载体。
[0012]本专利技术还提供了含有所述地衣芽孢杆菌的细胞催化剂。
[0013]在一种实施方式中，所述细胞催化剂的制备方法为：将所述重组地衣芽孢杆菌在培养基中培养一段时间，收集菌体作为全细胞催化剂。
[0014]在一种实施方式中，所述培养基为CMC发酵培养基，含有：蔗糖100g/L、棉籽蛋白30g/L、K2HPO4·
3H2O 9.12g/L、KH2PO
4 1.36g/L、(NH4)2HPO
4 10g/L，pH 7.5。
[0015]在一种实施方式中，所述培养是在37℃培养至少48h。
[0016]本专利技术还提供所述重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)
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柠苹酸的方法。
[0017]在一种实施方式中，所述全细胞转化体系中，菌体细胞按终浓度计，OD
600
为70～80。
[0018]在一种实施方式中，所述全细胞转化体系中，葡萄糖浓度为50～150g/L。
[0019]在一种实施方式中，所述全细胞转化体系的初始pH为4～9.5，或6.5～7.5，或7。
[0020]在一种实施方式中，所述全细胞转化在30～37℃、150～250rpm下进行反应。
[0021]在一种实施方式中，所述全细胞转化的反应时间≥24h，或≥48h，或≥72h。
[0022]在一种实施方式中，所述方法是在37℃、pH 7.0、底物浓度为100g/L、菌体浓度OD
600
为70、摇床转速为250r/min的条件下转化120h。
[0023]本专利技术还要求保护所述重组菌、细胞催化剂或所述方法在生产含(R)
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柠苹酸的产品中的应用。
[0024]有益效果：
[0025](1)本专利技术以抗逆性强、酶系丰富的地衣芽孢杆菌作为底盘细胞，引入异源柠苹酸合酶搭建了柠苹酸合成途径，解决了利用大肠杆菌在工业化生产柠苹酸过程中噬菌体侵染的问题。
[0026](2)本专利技术首次将地衣芽孢杆菌全细胞转化系统应用于柠苹酸的合成，通过优化重组菌株全细胞转化产柠苹酸的条件，能够显著提高柠苹酸的产量及转化率，转化120h可生成(R)
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柠苹酸8.57g/L，转化率为142.84mg/g葡萄糖，是目前报道的摇瓶培养合成(R)
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柠苹酸的最高水平。
附图说明
[0027]图1：地衣芽孢杆菌中柠苹酸合成途径。
[0028]图2：重组质粒pHY
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P
Shuttle09
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cimA3.7的构建及验证。
[0029]图3：制备全细胞催化剂的条件优化；其中，a：发酵培养基的选择；b：重组地衣芽孢杆菌的发酵结果。
[0030]图4：标样(葡萄糖、R
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柠苹酸)和样品的液相色谱图。
[0031]图5：重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)
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柠苹酸的条件优化a：菌体浓度；b：摇床转速；c：温度；d：葡萄糖浓度；e：pH；f：转化时间。
具体实施方式
[0032]培养基：
[0033]LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L(固体培养基加1.5％的琼脂粉)。
[0034]CMA发酵培养基：蛋白胨FP321 20g/L、酵母粉FM408 10g/L、葡萄糖100g/L、玉米浆干粉5g/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可转化生产(R)
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柠苹酸的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，以地衣芽孢杆菌为宿主，引入异源柠苹酸合酶搭建了(R)
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柠苹酸合成途径；所述柠苹酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述柠苹酸合酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1或2所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICIM B1391为宿主，以质粒pHY
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PLK300为表达载体。4.含有权利要求1～3任一所述地衣芽孢杆菌的细胞催化剂。5.制备权利要求4所述细胞催化剂的方法，其特征在于，将权利要求1～4任一所述的重组地衣芽孢杆菌在培养基中培养一段时间，收集菌体作为全细胞催化剂。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李由然，石贵阳，沈佳颖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：