一种工程微生物及趋化受体的配体筛选方法技术

本发明专利技术具体涉及一种工程微生物及趋化受体的配体筛选方法。病原菌的化学趋向性与病原菌的粘附和定植相关，是多种胃肠道病菌致病的重要因素，目前尚缺乏对病原菌趋化受体功能和配体筛选的研究工具。本发明专利技术提供了一种大肠杆菌的编辑方式，将外源病原菌的趋化受体插入所述大肠杆菌Tar区域获得一种杂合受体，携带该杂合受体的大肠杆菌能够表现所述病原菌的趋向活性，为配体筛选提供了有力的研究工具，并为抗感染药物的开发提供了新的思路。此外，本发明专利技术提供的技术也可以应用于其它微生物，例如动植物共生菌、动植物病原菌、海洋细菌、古菌等趋化受体的配体信号分子发掘中，为受体的功能研究及病原菌抑制剂的开发提供具有普适性的方法支持。方法支持。方法支持。

【技术实现步骤摘要】
一种工程微生物及趋化受体的配体筛选方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种工程微生物及微生物趋化受体的配体筛选技术，包括筛选引诱剂、驱散剂与拮抗剂，发展了该技术在胃肠道病原菌空肠弯曲菌趋化受体的配体筛选中的应用，并利用该技术发现了抵抗空肠弯曲菌趋化性与感染的抑制剂。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]胃肠道病原菌是威胁人类日常健康的重要因素，食源性病原菌导致的疾病发病率居各类疾病总发病率的首位。常见的消化道病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等。其中，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌轻度感染可能导致恶心、呕吐、腹痛、头痛、畏寒和腹泻，重度感染可能导致痉挛和休克；金黄色葡萄球菌则可能导致局部化脓感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感；空肠弯曲菌可导致人类以水样或血性腹泻为特征的急性胃肠道疾病以及脑膜炎、自身免疫性神经性麻痹等并发症。基于上述胃肠道病原菌对人类健康造成的威胁，病原菌感染已经成为世界最突出的卫生问题。开发病原特异性的替抗类新药，减少抗生素的使用，遏制细菌的耐药性，是亟待解决的重大问题。新型替抗类药物开发的关键在于需要基于病原菌的致病机制，探寻潜在的药物靶点，并针对靶点设计抗感染药物，开发新型病原菌防控产品。
[0004]许多能运动的细菌及古菌具有化学趋向性，例如上述胃肠道病原菌中的大肠杆菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、李斯特菌都具有运动性和趋化性，能够对外界物质的浓度梯度产生趋向或躲避的反应。趋化性的作用机制主要在于细菌表达的具有各种专一性的跨膜或胞质趋化受体。细菌通过趋化受体检测到胞外环境中相关物质的浓度变化，并转变为胞内信号促使细菌改变运动方向。研究表明，趋化性是许多胃肠道病原菌重要的毒力因子，可以促进其对宿主细胞的黏附和定植，对于病原菌感染的初始阶段尤其重要。揭示病原菌信号感应和致病性之间联系的核心在于发现致病相关的信号分子。经典的信号分子是作为配体与趋化受体的配体结合结构域(ligand
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binding domain,LBD)直接结合。然而，目前对于病原菌趋化受体的配体信号分子的信息了解很少，因此亟需发展针对病原菌趋化受体信号分子的靶向筛选策略，阐明其在致病过程中的功能，为设计以信号受体为靶点的抑制病原菌环境信号感应的新型抗感染药物提供新思路。
[0005]发掘病原菌的信号分子对抑制病原菌相关疾病、对抗病原菌耐药性具有重要意义，针对病原菌趋化受体的驱散剂或拮抗剂的开发有望提供有效抑制病原菌趋化性及感染的新型药物。但是，目前本领域对于大多数细菌的趋化受体可以结合的配体并不清楚，特别是功能趋化受体配体的筛选具有较大难度。其原因之一在于，趋化受体LBD的蛋白质序列突
变率较高，其能够结合的不同配体之间的结构相似度较低，导致研究人员难以通过生物信息学等方式对潜在的配体结构进行计算和预测；原因之二在于，细菌基因组中趋化受体数量众多，研究人员无法基于现有菌株构建实验模型以研究单一趋化受体的功能；原因之三在于，部分病原菌需要在相应级别的细菌实验室中进行培养和操作，获得生物样本困难也提高了针对病原菌趋化受体的配体发掘及抑制剂设计工作开展的难度。

技术实现思路

[0006]为了注释胃肠道病原菌趋化受体的功能，研究趋化性与致病性之间的关系并开发以趋化受体为靶点的新型抗感染药物，需要发展对于目标受体的配体信号分子的靶向筛选方法。大肠杆菌的趋化系统是研究细菌趋化性的经典模型。本专利技术提供了一种构建胃肠道病原菌趋化受体与大肠杆菌趋化受体的杂合受体来筛选和发现未知功能趋化受体的配体的新方法，利用大肠杆菌的趋化系统建立新的病原菌趋化受体的配体化合物筛选体系，为胃肠道病原菌趋向活性的研究提供了有力的研究工具。另一方面，本专利技术提出表达在大肠杆菌中的杂合受体可以应用于驱散剂和拮抗剂的筛选和发现中，为以趋化受体为靶点抑制病原菌趋化性及感染的新药设计提供理论和技术支撑。此外，本专利技术提供的技术也可以应用于其它微生物，例如肠道共生菌、植物病原菌、植物根际微生物、海洋细菌、古菌等趋化受体的配体信号分子发掘中，为受体的功能研究及病原菌抑制剂的开发提供具有普适性的方法支持。
[0007]基于上述技术效果，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术第一方面，提供一种工程微生物，所述微生物中转入外源核苷酸序列，用于编码病原菌趋化受体。
[0009]由于难以直接研究病原菌目标受体的功能，本专利技术联想到将目标趋化受体转移至其他微生物“载体”中对其趋向活性进行单一性的表达测定。进一步的，本专利技术联想到将所述病原菌趋化受体LBD转移至大肠杆菌趋化受体的胞质信号结构域(cytoplasmic signaling domain,CSD)，获得一种目标趋化受体与大肠杆菌趋化受体的杂合受体。经验证，该杂合受体能够良好的表达所述病原菌目的基因并控制趋向活性，可用于病原菌趋化受体的配体筛选及功能确认。基于目标趋化受体的配体信息的确认，本领域技术人员可以相应地开发抑制趋向活性的拮抗剂，对病原菌感染的初始阶段进行控制。
[0010]本专利技术第二方面，提供一种配体信号分子筛选方法，该方法基于第一方面所述工程微生物对胃肠道病原菌趋化受体的配体进行筛选。
[0011]本专利技术证实的实施方式中，所述筛选方法用于空肠弯曲菌趋化受体的配体筛选。
[0012]空肠弯曲菌是存在于一些动物，特别是家禽胃肠道中的共生微生物，主要通过污染食物的方式传播给人类，导致人类以水样或血性腹泻为特征的急性胃肠道疾病以及脑膜炎、自身免疫性神经性麻痹等并发症。目前对于空肠弯曲菌趋化受体Tlp1没有报道与其相关的配体信号分子。筛选并发现空肠弯曲菌趋化受体Tlp1可以感应的配体对于理解其致病机理以及与宿主的相互作用机制至关重要。本专利技术将应用空肠弯曲菌Tlp1
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LBD与大肠杆菌Tar
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CSD设计的杂合受体Tlp1
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Tar，在5种趋化受体都缺失，但只表达了单一Tlp1
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Tar杂合受体的大肠杆菌中筛选Tlp1
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LBD的配体，包括引诱剂和驱散剂。驱散剂的发现有望应用于制备抗病原菌感染的药物。通过化合物高通量筛选，并结合微流控、等温滴定量热等实验技
术手段，本专利技术提供甲酸作为空肠弯曲菌趋化受体Tlp1的配体引诱剂，可激发该病菌对甲酸的正趋化响应。
[0013]本专利技术第三方面，提供一种抵抗空肠弯曲菌趋化性的抑制剂，所述抑制剂为乙酸，是Tlp1配体甲酸的拮抗剂。该抑制剂的基于第二方面所述的配体筛选技术筛选得到。
[0014]本专利技术提出乙酸可以与Tlp1
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LBD的配体结合口袋相结合，并与引诱剂甲酸竞争同一个结合位点，但乙酸不能引起表达Tlp1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程微生物，其特征在于，所述微生物中转入外源核苷酸序列，用于编码病原菌趋化受体。2.如权利要求1所述工程微生物，其特征在于，所述微生物为包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或固氮伯克氏菌中的一种。3.如权利要求2所述工程微生物，其特征在于，所述微生物采用大肠杆菌；所述大肠杆菌中具有外源核苷酸序列与Tar受体的杂合受体；所述外源核苷酸序列的插入大肠杆菌Tar受体的胞质信号区，与Tar受体的融合位点包括跨膜螺旋上方、TM2螺旋内部或HAMP区之后。4.如权利要求1所述工程微生物，其特征在于，所述细菌趋向性受体为胃肠道病原菌趋化受体。5.如权利要求4所述工程微生物，其特征在于，所述胃肠道病原菌为空肠弯曲菌，所述趋化受体为Tlp1。6.一种配体信号分子筛选方法，其特征在于，该方法基于权利要求1
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5任一项所述工程微生物对胃肠道病原菌趋化受体的配体进行筛选。7.如权利要求6所述配体信号分子筛选方法，其特征在于，所述胃肠道病原菌为空肠弯曲菌菌株NCTC11168，所述趋化受体为Tlp1。8.如权利要求6所述配体信号分子筛选方法，其特征在于，所述方法用于筛选趋化受体的配体引诱剂、驱散剂及拮抗剂。9.如权利要求7或8所述配体信号分子筛选方法，其特征在于，所述筛选功能受体配体信号分子的具体方法如下：将确认的编码Tlp1
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LBD的外源核苷酸片段构成的杂合受体转入微生物大肠杆菌中，通过鉴别大肠杆菌的趋化性是否发生改变从而...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕双玉，王雪，赵琪，段晶晶，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：