利用木糖生产制造技术

本发明专利技术公开了一种利用木糖生产聚

【技术实现步骤摘要】
中，其保藏编号为
GDMCC NO.61850。
[0010]本申请中使用的
Halomonas lutescens MDF
‑9菌株已于
2021
年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心
(
简称
GDMCC
地址：广州市先列中路
100
号大院
59
号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编
510070)。
保藏号为
GDMCC NO.61850。
菌株名称为
MDF
‑9，分类命名为盐单胞菌
(Halomonas lutescens)。
[0011]进一步的，所述步骤
S3
菌株中，除了导入
S1
和
S2
中得到的载体质粒外，还导入一个包含
HEO
‑
xylA
‑
xfp
目的基因序列的载体质粒，所述
HEO
‑
xylA
‑
xfp
目的基因序列由体外扩增得到
。
[0012]进一步的，所述步骤
S3
菌株中，除了导入
S1
和
S2
中得到的载体质粒外，还导入一个包含
HEO
‑
xylA
‑
DTE
‑
Fuck
‑
FucA
目的基因序列的载体质粒，所述
HEO
‑/>xylA
‑
DTE
‑
Fuck
‑
FucA
目的基因序列由体外扩增得到
。
[0013]进一步的，所述步骤
S1、
使用的载体为
pSEVA321
，步骤
S2
使用的载体为
pSEVA341。
[0014]进一步的，所述步骤
S1、S2
中目的基因的扩增程序为：
(1)
预变性：温度
95℃
，时间
3min
；
(2)
变性：温度
95℃
，时间
15sec
；
(3)
退火：温度
56
‑
60℃
，时间
15sec
；
(4)
延伸：温度
72℃
，时间
30
‑
60sec/Kb
；
(5)
步骤
(2)
～
(4)
循环
35
次；
(6)
彻底延伸：温度
72℃
，时间
5min。
[0015]进一步的，步骤
S1、S2
中的连接体系为：载体片段2μ
L、
目的基因片段
2.5
μ
L、Gibson
连接混合酶5μ
L。
[0016]本专利技术还提供一种合成聚
(3
‑
羟基丁酸酯
‑
co
‑4‑
羟基丁酸酯
)
的菌株，由所述的构建方法得到
。
[0017]本专利技术还提供一种使用所述菌株生产聚
(3
‑
羟基丁酸酯
‑
co
‑4‑
羟基丁酸酯
)
的方法，包括如下步骤：
[0018](1)
种子液制备；
[0019](2)
摇瓶种子培养；
[0020](3)
发酵培养
。
[0021]进一步的，所述步骤
(3)
中发酵罐温度为
30
～
42℃
，
pH
为
6.5
～
11
，时间为
36
～
50h。
[0022]进一步的，所述步骤
(3)
中发酵培养基组分包括：木糖
30g/L
，氯化钠
50g/L
，酵母粉
1.2g/L
，尿素
0.2
～
3g/L
，无水硫酸镁
0.2g/L
，磷酸二氢钾
1.5
～
5.5g/L
，
Fe(III)
‑
NH4‑
Citrate 5g/L
，
CaCl2·
2H2O 2g/L
，
HCl 12mol/L
，
ZnSO4·
7H2O 0.1g/L
，
MnCl2·
4H2O 0.03g/L
，
H2BO30.3g/L
，
CoCl2·
6H2O 0.2g/L
，
CuSO4·
5H2O 0.01g/L
，
NiCl2·
6H2O 0.02g/L
，
NaMoO4·
2H2O0.03g/L。
[0023]综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
[0024]1.
本专利技术利用木糖为前体化合物合成
P34HB
，解决了无法利用木糖合成
P34HB
的技术问题，降低了生产
P34HB
原材料的成本
。
[0025]2.
本专利技术利用木糖作为原料，安全无毒性，减少生产工艺中原料对微生物的毒害作用
。
[0026]3.
本专利技术构建了木糖为前体的联合代谢途径菌株，不仅提高了
P34HB
的产量，还提高了
4HB
的含量，提高生产效率
。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图
。
[0028]图1为本专利技术的三条不同的木糖代谢途径生产
P34HB
通路图；
[0029]图2为本专利技术实施例1中构建过程使用的
pSEVA321
xylBCDX
质粒图谱；
[0030]图3为本专利技术实施例1中
xylB
‑
xylC
‑
xylD
‑
xylX
目的片段电泳图；
[0031]图4为本专利技术实施例1中构建过程使用的
pSEVA341
Kivd
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用木糖生产聚
(3
‑
羟基丁酸酯
‑
co
‑4‑
羟基丁酸酯
)
的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1
：体外扩增
xylB
‑
xylC
‑
xylD
‑
xylX
目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S2
：体外扩增
Kivd
‑
YqhD
目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；
S3
：将
S1、S2
所述载体质粒共同导入菌株中；所述菌株为
Halomonas lutescens MDF
‑9，保藏编号为
GDMCCNO:61850。2.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤
S3
菌株中，除了导入
S1
和
S2
中得到的载体质粒外，还导入一个包含
HEO
‑
xylA
‑
xfp
目的基因序列的载体质粒，所述
HEO
‑
xylA
‑
xfp
目的基因序列由体外扩增得到
。3.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤
S3
菌株中，除了导入
S1
和
S2
中得到的载体质粒外，还导入一个包含
HEO
‑
xylA
‑
DTE
‑
Fuck
‑
FucA
目的基因序列的载体质粒，所述
HEO
‑
xylA
‑
DTE
‑
Fuck
‑
FucA
目的基因序列由体外扩增得到
。4.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤
S1
使用的载体为
pSEVA321
，步骤
S2
使用的载体为
pSEVA341。5.
根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤
S1、S2
中目的基因的扩增程序为：
(1)
预变性：温度
95℃
，时间
3min
；
(2)
变性：温度
95℃
，时间
15sec
；
(3)
退火：温度
56
‑
60℃
...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶健文，吕金艳，司徒卫，余柳松，林艺娜，黄劭立，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：