一种制造技术

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种

【技术实现步骤摘要】
一种sgRNA表达载体、CRISPR基因编辑表达质粒及其制备方法


[0001]本申请涉及生物
，尤其涉及一种
sgRNA
表达载体
、CRISPR
基因编辑表达质粒及其制备方法
。

技术介绍

[0002]化石燃料的大量开采使用对环境造成的污染破坏以及化石能源的不可再生性驱动了可持续能源替代品的开发；以自产乙醇梭菌
(Clostridium autoethanogenum)
为代表的产乙酸菌是可利用一碳气体为原料并通过气体发酵技术将工业废气或含有
CO、CO2和
H2的合成气体转化为燃料乙醇的可持续能源替代品之一
。
而为了进一步挖掘梭菌的生物合成潜力，必须对菌株进行改良，目前菌株改良有两种方式：一是表达其他物种来源的异源代谢途径，二是改造菌株自身包含的天然代谢途径
。
但无论那种方式，均需开发高效的基因编辑工具
。
[0003]目前，基于
CRISPR/Cas9
的基因编辑技术已成功在梭菌中应用，但是由于梭菌的同源重组效率极低，且
Cas9
蛋白引起的双链断裂很难被修复，因此
Cas9
蛋白的表达对梭菌的致死性极强
。
有研究者通过使用诱导型启动子控制
Cas9
蛋白表达，或通过在
Cas9
中引入突变使得
Cas9
蛋白只能切割单链，这两种措施均提高了梭菌中基因编辑成功率
。
[0004]然而现阶段的
CRISPR/Cas9
基因编辑质粒以
pRECas1
质粒为主，该质粒的图谱和序列包括
Cas9
蛋白表达模块
(
诱导型表达
)、sgRNA
表达模块以及同源臂模块，在实际使用阶段长度为
157bp
的
sgRNA
表达模块和同源臂模块均需通过
PCR
扩增得到，再通过酶切连接克隆至
pRECas1
载体中，由于不同的
sgRNA
基因编辑效率不同，此外出于基因敲除或基因敲入需求，所选同源臂也不尽相同，因此按上述构建方法需要每次都将构建完成的质粒进行测序验证，而且
sgRNA
表达模块以及同源臂模块均没有在质粒保存，每次使用需要重新构建，不利于灵活组合使用和共享
。
因此如何提供一种无需重新构建且对构建完成的质粒无需进行测序验证的
CRISPR
基因编辑表达载体，是目前亟需解决的技术问题
。

技术实现思路

[0005]本申请提供了一种
sgRNA
表达载体
、CRISPR
基因编辑表达质粒及其制备方法，以解决现有技术中
CRISPR/Cas9
基因编辑质粒需要每次都将构建完成的质粒进行测序验证且每次使用都需要重新构建的技术问题
。
[0006]第一方面，本申请提供了一种
sgRNA
表达载体，所述质粒包括：连入了表达绿色荧光蛋白核苷酸序列的改进
sgRNA
表达模块，所述改进
sgRNA
表达模块的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列
。
[0007]可选的，所述改进
sgRNA
表达模块的长度为
1150bp
～
1200bp。
[0008]可选的，所述改进
sgRNA
表达模块位于
EcoRV
位点
。
[0009]可选的，所述表达载体包括
PUC57
‑
Kan
载体
。
[0010]第二方面，本申请提供了一种
CRISPR
基因编辑表达质粒，所述表达质粒包括第一
方面所述的表达载体中的改进
sgRNA
表达模块
。
[0011]可选的，所述表达质粒还包括靶向序列，所述靶向序列由乙醇梭菌的
guide RNA
靶向序列设计得到
。
[0012]可选的，所述
guide RNA
靶向序列包括
LDHA
基因的第一
guide RNA
靶向序列
、LDHA
基因的第二
guide RNA
靶向序列
、BUDA
基因的第一
guide RNA
靶向序列
、BUDA
基因的第二
guide RNA
靶向序列
、THLA
基因的第一
guide RNA
靶向序列和
THLA
基因的第二
guide RNA
靶向序列中的至少一种
。
[0013]可选的，所述
LDHA
基因的第一
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.2
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；和
/
或，
[0014]所述
LDHA
基因的第二
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.3
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；和
/
或，
[0015]所述
BUDA
第一基因的
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.4
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；
[0016]所述
BUDA
第二基因的
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.5
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；和
/
或，
[0017]所述
THLA
基因的第一
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.6
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；
[0018]所述
THLA
基因的第二
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.7
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列
。
[0019]第三方面，本申请提供了一种制备第二方面所述的表达质粒的方法，所述方法包括：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
sgRNA
表达载体，其特征在于，所述表达载体包括：连入了表达绿色荧光蛋白核苷酸序列的改进
sgRNA
表达模块，所述改进
sgRNA
表达模块的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列
。2.
根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述改进
sgRNA
表达模块的长度为
1150bp
～
1200bp。3.
根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述改进
sgRNA
表达模块位于
EcoRV
位点
。4.
根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括
PUC57
‑
Kan
载体
。5.
一种
CRISPR
基因编辑表达质粒，其特征在于，所述表达质粒包括如权利要求1‑4任一项所述的表达载体中的改进
sgRNA
表达模块
。6.
根据权利要求5所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒还包括靶向序列，所述靶向序列由乙醇梭菌的
guide RNA
靶向序列设计得到
。7.
根据权利要求6所述的表达质粒，其特征在于，所述
guide RNA
靶向序列包括
LDHA
基因的第一
guide RNA
靶向序列
、LDHA
基因的第二
guide RNA
靶向序列
、BUDA
基因的第一
guide RNA
靶向序列
、BUDA
基因的第二
guide RNA
靶向序列
、THLA
基因的第一
guide RNA
靶向序列和
THLA
基因的第二
guide RNA
靶向序列中的至少一种
。8.
根据权利要求7所述的表达质粒，其特征在于，所述
LDHA
基因的第一
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.2
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；和
/
或，所述
LDHA
基因的第二
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.3
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；和
/
或，所述
BUDA
第一基因的
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.4
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；所述
BUDA
第二基因的
guide RNA
靶向序列的核苷酸序列包括与如
SEQ ID NO.5
所示的核苷酸序列同源性
≥90
％的核苷酸序列；和
/
或，所述
THLA
基因的第一
guide RNA
靶向序列的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁楠，白雪，晁伟，莫志朋，佟淑环，张春悦，岳美琪，
申请(专利权)人：北京首钢朗泽科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：