生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株及其构建方法与应用。该构建方法包括对出发需钠弧菌进行如下至少一种改造，获得所述需钠弧菌基因工程重组菌株：抑制或降低VPN2表达；抑制或降低VPN1表达；抑制或降低pflB基因表达或降低pflB含量或抑制pflB活性；抑制或降低lldh基因表达或降低lldh含量或抑制lldh活性；抑制或降低dldh基因表达或降低dldh含量或抑制dldh活性；抑制或降低pps1基因和/或pps2基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸合酶的活性；抑制或降低aceE基因表达或降低aceE含量或抑制aceE活性；抑制或降低ppc基因表达或降低ppc含量或抑制ppc活性等。该构建方法构建的重组菌株具有生产周期短、物料成本低、合成效率高的特点。合成效率高的特点。

【技术实现步骤摘要】
生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种生产丙酮酸需钠弧菌重组菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]丙酮酸，又称2
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氧代丙酸或乙酰甲酸，为浅黄色至黄色的透明液体，有酸味。丙酮酸分子结构中含有活化酮和羧基基团，是一种基本的化工原料，广泛应用于化学、制药、食品、农业及环保等各个领域。丙酮酸是所有生物细胞糖代谢及体内多种物质相互转化的重要中间体，广泛参与生物体内糖、脂肪、蛋白质的代谢过程。另外，丙酮酸也是一些高附加值化学品的合成前体，例如D/L
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丙氨酸、L
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色氨酸、L
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酪氨酸、左旋多巴、N
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乙酰
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D
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神经氨酸等产品(Krzysztof Cybulski，Ludwika Tomaszewska
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Hetman，Magdalena Rakicka，Piotr Juszczyk，AnitaProduction of pyruvic acid from glycerol by Yarrowia lipolytica.Folia Microbiol.2019，64(6)：809
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820.)。
[0003]目前，工业上可通过化学合成和微生物发酵等方法生产丙酮酸。化学合成法主要以酒石酸或乳酸为原料，在高温高压条件下或通过金属催化剂催化合成丙酮酸。化学合成法反应条件苛刻、污染严重、转化率低、生产成本高，难以满足目前工业生产要求。微生物发酵法具有发酵条件温和、绿色可持续、转化率高、成本低的特点，因而更具有市场竞争优势。
[0004]通过代谢工程技术对丙酮酸合成途径进行改造，已经在多种微生物中实现了丙酮酸的发酵合成，例如大肠杆菌(Escherichia coli)(Yihui Zhu，Mark A Eiteman，Ronni Altman，Elliot Altman.High glycolytic flux improves pyruvate production by a metabolically engineered Escherichia coli strain.Appl Environ Microbiol.2008，74(21)：6649
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55.)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(高超，曹梦豪，马翠卿，许平.一种通过敲除丙酮酸转运蛋白基因提高工程菌发酵生产丙酮酸的方法.山东大学，CN 202010441899.6.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(李亿，王青艳，秦艳，朱婧，梁戈，彭龙云，潘丽霞.一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法.广西科学院，CN 201910358778.2.)、光滑球拟酵母(Candida glabrata)(Zhengshan Luo，Weizhu Zeng，Guocheng Du，Jian Chen，Jingwen Zhou.Enhancement of pyruvic acid production in Candida glabrata by engineering hypoxia
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inducible factor 1.Bioresour Technol.2020，295：122248.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(Krzysztof Cybulski，Ludwika Tomaszewska
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Hetman，Magdalena Rakicka，Piotr Juszczyk，AnitaProduction of pyruvic acid from glycerol by Yarrowia lipolytica.Folia Microbiol.2019，64(6)：809
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820.)等等。但是利用这些微生物发酵生产丙酮酸的周期长，产酸速率低，例如生长速率较快的大肠杆菌发酵周期也达到44h(Yihui Zhu，Mark A Eiteman，Ronni Altman，Elliot Altman.High glycolytic flux improves pyruvate production by a metabolically engineered Escherichia coli strain.Appl Environ Microbiol.2008，74(21)：6649
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55.)，产酸克雷伯氏菌的发酵周期
为42h(高超，曹梦豪，马翠卿，许平.一种通过敲除丙酮酸转运蛋白基因提高工程菌发酵生产丙酮酸的方法.山东大学，CN 202010441899.6.)，而酿酒酵母的发酵周期长达76h(李亿，王青艳，秦艳，朱婧，梁戈，彭龙云，潘丽霞.一种高产丙酮酸的酿酒酵母工程菌株及其发酵方法.广西科学院，CN 201910358778.2.)。菌种的发酵周期长，导致丙酮酸的生产成本较高。
[0005]需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种生长十分快速的海洋细菌，繁殖一代最快只需9.4min，属于兼性厌氧型的革兰氏阴性菌。需钠弧菌具有底物利用速率快、底物谱广、对人体无致病性危害等优点，是近几年发展起来的一种应用于合成生物学领域的新型底盘细胞。目前，利用代谢工程技术改造需钠弧菌，通过发酵生产丙酮酸的方法尚未见报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的之一在于提供需钠弧菌基因工程重组菌株的构建方法。
[0007]本专利技术提供了一种需钠弧菌基因工程重组菌株的构建方法，包括对出发需钠弧菌进行如下改造，获得所述需钠弧菌基因工程重组菌株：
[0008]A8、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。
[0009]可选地，根据上述的构建方法，还包括对出发需钠弧菌进行如下至少一种改造：
[0010]A1、抑制或降低噬菌体基因簇VPN2表达；
[0011]A2、抑制或降低噬菌体基因簇VPN1表达；
[0012]A3、抑制或降低丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因表达或降低丙酮酸甲酸裂解酶的含量或抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性；
[0013]A4、抑制或降低L
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乳酸脱氢酶lldh基因表达或降低L
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乳酸脱氢酶的含量或抑制L
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乳酸脱氢酶的活性；
[0014]A5、抑制或降低D
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乳酸脱氢酶dldh基因表达或降低D
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乳酸脱氢酶的含量或抑制D
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乳酸脱氢酶的活性；
[0015]A6、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸合酶的活性；
[0016]A7、抑制或降低丙酮酸脱氢酶复合体基因表达本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种需钠弧菌基因工程重组菌株的构建方法，其特征在于：包括对出发需钠弧菌进行如下至少一种改造，获得所述需钠弧菌基因工程重组菌株：A1、抑制或降低噬菌体基因簇VPN2表达；A2、抑制或降低噬菌体基因簇VPN1表达；A3、抑制或降低丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因表达或降低丙酮酸甲酸裂解酶的含量或抑制丙酮酸甲酸裂解酶的活性；A4、抑制或降低L
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乳酸脱氢酶lldh基因表达或降低L
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乳酸脱氢酶的含量或抑制L
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乳酸脱氢酶的活性；A5、抑制或降低D
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乳酸脱氢酶dldh基因表达或降低D
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乳酸脱氢酶的含量或抑制D
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乳酸脱氢酶的活性；A6、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸合酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸合酶的活性；A7、抑制或降低丙酮酸脱氢酶复合体基因表达或降低丙酮酸脱氢酶复合体的含量或抑制丙酮酸脱氢酶复合体的活性；A8、抑制或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因表达或降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的含量或抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：A1通过敲除基因组上的VPN2实现；A2通过敲除基因组上的VPN1实现；A3通过敲除pflB基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸甲酸裂解酶失活实现；A4，通过敲除lldh基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致L
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乳酸脱氢酶失活实现；A5通过敲除dldh基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致D
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乳酸脱氢酶失活实现；A6通过单敲除磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因中的ppsl基因或pps2基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变，或通过双敲除ppsl基因和pps2基因的全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致磷酸烯醇式丙酮酸合酶失活实现；A7通过在丙酮酸脱氢酶复合体E1亚基aceE基因起始密码子上游插入人工合成的或天然的调控元件而下调aceE基因的表达，和/或将aceE基因起始密码子替换为稀有起始密码子导致丙酮酸脱氢酶复合体的表达水平或酶活力降低，和/或敲除aceE基因全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致丙酮酸脱氢酶复合体失活实现；A8、通过在ppc基因起始密码子上游插入人工合成的或天然的调控元件而下调ppc基因的表达，和/或将ppc基因起始密码子替换为稀有起始密码子导致磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达水平或酶活力降低，和/或敲除ppc基因全部或部分编码框序列或对其进行移码突变而导致磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶失活实现。3.权利要求1或2所述的构建方法构建的需钠弧菌基因工程重组菌株。4.根据权利要求3所述的菌株，其特征在于：所述菌株为命名PYR01的菌株，所述PYR01通过对所述出发需钠弧菌进行A1改造获得的
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【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，吴凤礼，张媛媛，彭彦峰，周丹，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：