一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌及其构建方法和表达方法技术

本发明专利技术公开了一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌及其构建方法和表达方法，属于外源表达技术领域。本发明专利技术提供了一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌的构建方法，以含有辅助基因敲除质粒的耻垢分枝杆菌感受态为基底细胞，先转入带有亲和纯化标签的结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，再敲除耻垢分枝杆菌ATP合成酶基因组，反复传代后收集不含辅助基因敲除质粒的菌株，利用原核表达的方法向该菌株中转入结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，得表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌。利用本发明专利技术所述构建方法，解决了异源表达必需基因本底基因难以敲除以及多亚基蛋白复合物异源表达杂合复合物形成的问题。合物形成的问题。合物形成的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌及其构建方法和表达方法


[0001]本专利技术属于外源表达
，具体涉及一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌及其构建方法和表达方法。

技术介绍

[0002]结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，多年都是由单一致病因子引起的死亡率最高的传染病。WHO发布的《2021年全球结核病报告》指出全球结核潜伏感染人群接近20亿。由耐多药及广泛耐药结核分枝杆菌引起的结核病更是严重威胁全人类的健康。为了实现对结核病的控制，人们迫切需要新的抗结核药物。由于结核分枝杆菌及相关分枝杆菌不能通过底物水平磷酸化途径获得足够的能量，它们的生长需要氧化磷酸化系统系统维持能量供应，因而结核分枝杆菌氧化磷酸化系统成为研发新型抗药物敏感性和耐药性结核病的重要靶点。氧化磷酸化系统中的膜蛋白复合物NDH
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1、NDH
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2、SDH
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1、SDH
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2、Cytbcc/aa3及Cytbd在传递电子的过程中伴随产生跨膜的质子移动力。之后质子移动力被ATP合成酶用于产生可直接利用的高能分子ATP。ATP的合成在结核分枝杆菌生长生存中发挥着重要作用，然而，结核分枝杆菌ATP合成酶的组成、功能机制及相关小分子抑制剂的作用机理尚不清晰，制约着开发活性更高的新型抑制剂。
[0003]由于表达纯化难度大，目前均是通过研究耻垢分枝杆菌ATP合成酶从而推理结核分枝杆菌ATP合成酶的结构功能及抑制剂的作用机制。然而基于基因组序列分析发现，相比于耻垢分枝杆菌ATP合成酶，结核分枝杆菌ATP合成酶存在药物靶点差异，因此结核分枝杆菌ATP合成酶精确的组装机制和功能机制仍有待完善，以更好地针对该靶点开发出理想的抗结核药物。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌及其构建方法和表达方法，解决了异源表达必需基因本底基因难以敲除的问题，在耻垢分枝杆菌中成功外源表达并纯化得到结核分枝杆菌ATP合成酶，避免了结核分枝杆菌的生物危害，操作简单，成本低廉，安全性好。
[0005]本专利技术提供了一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：(1)向耻垢分枝杆菌感受态细胞中转入带有亲和纯化标签的结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，得菌株a；所述耻垢分枝杆菌感受态细胞中含有辅助基因敲除质粒；
[0006](2)敲除所述菌株a中的耻垢分枝杆菌ATP合成酶基因组，得菌株b；
[0007](3)将所述菌株b在无卡那霉素抗性的平板培养基上反复传代，得不含辅助基因敲除质粒的菌株c；
[0008](4)向所述菌株c中转入包含结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇的原核表达载体，得表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌。
[0009]优选的，步骤(1)中将所述结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇插入到耻垢分枝杆菌感受态细胞的sodC基因位点上，使用链霉素作为筛选标记。
[0010]优选的，步骤(1)中所述结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0011]优选的，步骤(2)中所述敲除时，使用潮霉素作为筛选标记。
[0012]优选的，步骤(2)中所述耻垢分枝杆菌ATP合成酶基因组的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0013]本专利技术还提供了利用上述构建方法构建得到的表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌。
[0014]本专利技术还提供了利用上述表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌表达结核分枝杆菌ATP合成酶的方法，包括以下步骤：培养所述重组菌后利用乙酰胺诱导结核分枝杆菌ATP合成酶的表达。
[0015]优选的，所述培养的温度为37℃，所述培养过程中伴随振荡。
[0016]优选的，将培养的菌液降温到16℃后，利用乙酰胺诱导表达。
[0017]优选的，在利用乙酰胺诱导表达后，还包括收集菌体并破碎，对得到的耻垢分枝杆菌细胞膜总蛋白溶液进行纯化。
[0018]有益效果：本专利技术提供了一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌的构建方法，首先向含有辅助基因敲除质粒的耻垢分枝杆菌感受态细胞中转入带有亲和纯化标签的结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，得菌株a；敲除菌株a中的耻垢分枝杆菌ATP合成酶基因组，得菌株b；将所述菌株b在无卡那霉素抗性的平板培养基上反复传代，得不含辅助基因敲除质粒的菌株c；向所述菌株c中转入包含结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇的原核表达载体，得表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌。本专利技术所述重组菌的构建方法，解决了异源表达必需基因本底基因难以敲除的问题，解决了困扰当前科研界的技术瓶颈，避免了多亚基蛋白复合物异源表达杂合复合物形成的问题，为必需基因异源表达避免杂合问题提供了解决方案。
[0019]本专利技术利用构建得到的重组菌进行结核分枝杆菌ATP合成酶的表达和纯化，表达机理如图1所示，在耻垢分枝杆菌中外源表达结核分枝杆菌的蛋白避免了结核分枝杆菌的生物危害，操作简单，成本低廉，安全性好。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1为结核分枝杆菌ATP合成酶异源表达模式图；
[0022]图2为目标质粒A的图谱；
[0023]图3为目标质粒B的图谱；
[0024]图4为目标质粒C(pMV261
‑
mtbATP Synthase)的图谱；
[0025]图5为凝胶排阻色谱结果图，图中横坐标为色谱柱洗脱体积，单位为mL；纵坐标代
表280nm处紫外吸收，单位为mAU；
[0026]图6为BN
‑
PAGE结果图；
[0027]图7为负染电镜结果图，红圈为ATP合成酶典型形状。
具体实施方式
[0028]本专利技术提供了一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：(1)向耻垢分枝杆菌感受态细胞中转入带有亲和纯化标签的结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，得菌株a；所述耻垢分枝杆菌感受态细胞中含有辅助基因敲除质粒；
[0029](2)敲除所述菌株a中的耻垢分枝杆菌ATP合成酶基因组，得菌株b；
[0030](3)将所述菌株b在无卡那霉素抗性的平板培养基上反复传代，得不含辅助基因敲除质粒的菌株c；
[0031](4)向所述菌株c中转入包含结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇的原核表达载体，得表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌。
[0032]本专利技术首先向耻垢分枝杆菌感受态细胞中转入带有亲和纯化标签的结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，得菌株a；所述耻垢分枝杆菌感受态细胞中含有辅助基因敲除质粒。本专利技术所述耻垢分枝杆菌感受态细胞中含有辅助基因敲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)向耻垢分枝杆菌感受态细胞中转入带有亲和纯化标签的结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇，得菌株a；所述耻垢分枝杆菌感受态细胞中含有辅助基因敲除质粒；(2)敲除所述菌株a中的耻垢分枝杆菌ATP合成酶基因组，得菌株b；(3)将所述菌株b在无卡那霉素抗性的平板培养基上反复传代，得不含辅助基因敲除质粒的菌株c；(4)向所述菌株c中转入包含结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇的原核表达载体，得表达结核分枝杆菌ATP合成酶的重组菌。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中将所述结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇插入到耻垢分枝杆菌感受态细胞的sodC基因位点上，使用链霉素作为筛选标记。3.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述结核分枝杆菌ATP合成酶基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡红日，张玉莹，饶子和，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：