一种基于运动发酵单胞菌內源制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种基于运动发酵单胞菌內源

【技术实现步骤摘要】
一种基于运动发酵单胞菌內源CRISPR
‑
Cas3系统的基因表达调控方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于运动发酵单胞菌內源
CRISPR
‑
Cas3
系统的基因表达调控方法
。

技术介绍

[0002]运动发酵单胞菌
(Zymomonas mobilis)
具有许多理想微生物细胞工厂特性：
(1)
能天然产酒精，对酒精耐受性高，可以利用玉米秸秆水解物生产高浓度纤维素酒精；
(2)
是目前已知的唯一可以在厌氧条件下通过
Entner
‑
Doudoroff(ED)
途径代谢葡萄糖或果糖生产乙醇的微生物，其每代谢一分子的葡萄糖或者果糖只产生一分子的
ATP
，产能低，因而大部分碳源
(>95
％
)
被转化为产物乙醇，只有约2‑
2.6
％的碳源用于细胞生长，目标产物产率非常高；
(3)
基因组大小仅为约
2Mbp
，在开展基因组精简工作，构建最适基因组细胞工厂方面具有很大优势；
(4)
可在广泛的温度
(24
‑
45℃)
及
pH
范围
(3.5
‑
7.5)
生长；
(5)
是公认的
GRAS(Generally Recognized As Safe)
菌株
。
因此，运动发酵单胞菌作为天然发酵乙醇的微生物，在工业
、
食品饮料
、
医药领域都有着很大发展潜力
。
[0003]在运动发酵单胞菌中建立一个表达调控平台，通过抑制或激活某些基因可进一步充分发挥其优势性能
。
目前在运动发酵单胞菌中常用的代谢调控手段包括传统遗传学方法的基因敲除
、
增加基因拷贝数
、
调节启动子强度等，但通常耗时较长，效率太低，只能逐个完成，无法满足对复杂代谢通路高效多重调节的需求
。
近几年，随着
CRISPR
‑
Cas
技术的发展，基于
CRISPR
‑
Cas
系统的基因表达调控技术尤其具有快速
、
高效
、
准确等特点，开始展现它在代谢工程研究中的优势
。
虽然
CRISPR
‑
Cas12a
和
CRISPR
‑
Cas9
技术已成功应用于对运动发酵单胞菌的基因编辑等工作中，但均引入了外源遗传因子
(Cas
核酸酶
)
，增加了宿主的遗传背景，导致其无法作为理想的代谢工程菌株
。
[0004]因此，一种基于运动发酵单胞菌內源
CRISPR
‑
Cas3
系统的基因表达调控方法亟待提出
。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供一种基于运动发酵单胞菌內源
CRISPR
‑
Cas3
系统的基因表达调控方法
。
本专利技术提供了如下的技术方案，包括以下步骤：
[0006]步骤1：构建内源
CRISPRi/a
基因表达调控宿主菌株；
[0007]步骤2：构建
CRISPRi(
基因表达下调
)
载体；
[0008]步骤3：检测基因表达下调工具效果；
[0009]步骤4：构建
CRISPRa(
基因表达上调
)
载体；
[0010]步骤5：检测基因表达上调工具效果
。
[0011]优选的，所述步骤1中构建
CRISPRi
基因表达下调宿主菌株具体包括：利用内源
CRISPR
‑
Cas3
基因编辑系统，敲除
cas3
基因，或将
cas3
变为无
DNA
切割活性的
dcas3。
[0012]优选的，所述步骤1中构建
CRISPRa
基因表达上调宿主菌株具体包括：利用内源
CRISPR
‑
Cas3
基因编辑系统，将两个荧光蛋白基因
mCherry
和
EGFP
分别插入
ZM4
基因组，同时敲除
cas3
和
cas8
基因
。
[0013]优选的，所述步骤
S2
具体包括：
CRISPRi
载体包括在质粒上表达一个
Repeat
‑
Spacer
‑
Repeat(R
‑
S
‑
R)
形式的人工
CRISPR
簇，同时携带一个
mCherry
的表达框作为靶基因
。
[0014]优选的，所述步骤
S3
具体包括：将一系列
CRISPRi
载体转入相应的宿主细胞，利用流式细胞术检测红色荧光蛋白发光强度
。
[0015]优选的，所述步骤
S4
具体包括：所述
CRISPRa
载体包括一个
cas8
基因与激活因子
(
ω
或
SoxS)
融合表达框，同时携带一个人工
CRISPR
簇，用来表达特定的
crRNA
，介导系统靶向结合
DNA。
[0016]优选的，所述步骤
S5
具体包括：将一系列
CRISPRa
载体转入相应的宿主细胞，利用流式细胞术检测荧光蛋白发光强度
。
[0017]本专利技术相较于现有技术，具有以下有益效果：
[0018]本专利技术以
Z.mobilis 4
为模式菌株，在其自身基因组编码的
CRISPR
‑
Cas3
系统的基础上搭建的一套基因表达调控平台，为在运动发酵单胞菌中开展基础和应用研究提供一套强大的
CRISPR
‑
Cas3
基因表达调控工具，促进菌株的深入研究与应用
。
[0019]开发宿主內源
CRISPR
‑
Cas3
基因表达调控工具具有以下有益效果：
(1)
可有效避免外源
Cas
核酸蛋白对宿主产生的细胞毒性；
(2)
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于运动发酵单胞菌內源
CRISPR
‑
Cas3
系统的基因表达调控方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：构建内源
CRISPRi/a
基因表达调控宿主菌株；步骤2：构建
CRISPRi
载体；步骤3：检测基因表达下调工具效果；步骤4：构建
CRISPRa
载体；步骤5：检测基因表达上调工具效果
。2.
根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌內源
CRISPR
‑
Cas3
系统的基因表达调控方法，其特征在于：所述
CRISPRi
基因表达下调宿主菌株为敲除
cas3
基因，或将
cas3
变为无
DNA
切割活性的
dcas3
；所述
CRISPRa
基因表达上调宿主菌株为将两个荧光蛋白基因
mCherry
和
EGFP
分别插入
ZM4
基因组，同时敲除
cas3
和
cas8
基因
。3.
根据权利要求1所述的一种基于运动发酵单胞菌內源
CRISPR
‑
Cas3
系统的基因表达调控方法，其特征在于：所述
CRISPRi
载体包括在质粒上表达一个
Repeat
‑
Spacer
‑
Repeat(R
‑
S
‑
R)
形式的人工
CRISPR
簇，用来表达特定的
crRNA
，介导系统靶向结合
DNA
，在
CRISPRi
研究...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑艳丽，杨江科，傅宏媚，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：