一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法。本发明专利技术构建了由质粒pCas、带有靶向目的基因的sgRNA和待敲除片段上下游同源臂的重组质粒pTarget组成的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR
‑
Cas系统是细菌和古细菌通过长期演化获得的适应性免疫系统，某些细菌在遭到病毒入侵后，如果细菌没有因此死亡，会把病毒基因的一小段DNA存储到自身的一个称为CRISPR的DNA序列中。如果之后再次被这种病毒入侵，细菌能够根据储存在CRISPR列阵中的间隔序列将其识别，之后启动相关基因的转录对外源DNA剪切使其失效。CRISPR
‑
Cas系统有多个种类，CRISPR
‑
Cas9（CRISPR
‑
CasⅡ）技术是目前应用最广泛的一种，是由细菌的CRISPR
‑
Cas系统发展而来，主要用于靶向敲除或敲入几乎任何基因，该系统主要采用Cas9核酸酶，在真核生物和原核生物中直接利用sgRNA引导基因编辑系统。
[0003]CRISPR
‑
Cas切割双链DNA时，gRNA会与完全互补的靶标DNA单链形成gRNA
‑
DNA杂合双链。使用CRISPR
‑
Cas RNA引导性核酸酶的一个重要局限：会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变。此后陆续有研究直接说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术可以发生非特异性切割，引起基因组非靶向位点的突变，这样会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加，这一问题严重地限制了Cas9的应用。
[0004]由于sgRNA配对结合区域碱基有限，也许能够配对的DNA片段在基因组里有数个，但如果把sgRNA的定位区设计过长，则有一部分会被剪掉，失去功能。并且在局部不配对的情况下，sgRNA的定位区也有可能与相似的DNA序列结合，导致切割错误的基因。sgRNA(crRNA)在靠近PAM的地方存在一段种子(seed)序列，如果种子序列发生任何错配，就能导致靶点切割效率大跌甚至消失殆尽。基因组越庞大的生物越危险，脱靶效应导致的后果，可能是错误的表型，更麻烦的可能是假表型——删除了错误的基因，却与删除目标基因产生了相同的表型。所以，如何针对特定的基因组和靶标基因，设计合适的sgRNA以及上下同源臂引物，是使得基因敲除实现的技术要点。

技术实现思路

[0005]目前已有利用CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统定向敲除基因的方法，但是针对不同的基因组和靶标基因，设计合适的sgRNA以及上下同源臂引物，保证较高的敲除率，依然十分困难。
[0006]为解决上述问题，本专利技术提供了一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法来满足本领域内的这种需要。本专利技术提供的欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法，其对欧文氏菌的漆酶基因敲除率达到了82.22%。
[0007]一方面，本专利技术涉及一种欧文氏菌基因敲除方法，其包括：敲除ELAC_205基因的上游同源臂，敲除ELAC_205基因的下游同源臂和sgRNA；所述敲除ELAC_205基因的上游同源臂的引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游同源臂F1端引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的上游同源臂R1端引物；
所述敲除ELAC_205基因的下游同源臂的引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的下游同源臂F2端引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游同源臂R2端引物；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；在欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3中定向敲除漆酶ELAC_205基因。
[0008]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，采用质粒pCas和质粒pTargetF在欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3中定向敲除漆酶ELAC_205基因。
[0009]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，将所述质粒pCas电化学转化进入欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3中；将插入了敲除ELAC_205基因的上游同源臂的引物、敲除ELAC_205基因的下游同源臂的引物和sgRNA的重组质粒pTargetF转化浸入含pCas的欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3中，完成基因敲除，得到导入了双质粒的欧文氏菌
‑
pCas
‑
pTargetF菌株；将所述欧文氏菌
‑
pCas
‑
pTargetF菌株依次进行质粒pTargetF的消除和质粒pCas消除，得到定向敲除了欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3中漆酶ELAC_205基因的菌种。
[0010]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，所述质粒pCas电化学转化包括：制备欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3的感受态细胞，加入3~5
µ
L pCas质粒，冰上静置20min，1.5 KV电激，冰浴3min，加入700μL LB液体培养基，30℃，180rpm培养1h~2h。
[0011]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，质粒pTargetF的消除包括：将导入了双质粒的欧文氏菌
‑
pCas
‑
pTargetF菌株在含Km抗性的LB固体培养基中培养至云雾状，然后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG培养。
[0012]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，pCas质粒的消除包括：将pTargetF质粒消除后的菌株在含有Amp抗性的LB液体培养基中培养，30℃ 180rpm摇床培养至OD
600
值为0.5，之后将其转移到37℃ 180rpm摇床，培养至OD
600
值0.8
‑
1.2。
[0013]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，所述LB液体培养基包括：Typtone 10g/L、NaCl 10g/L、酵母粉5g/L。
[0014]进一步地，本专利技术提供的欧文氏菌基因敲除方法中，所述LB固体培养基为Typtone 10g/L、NaCl 10g/L、酵母粉5g/L、琼脂粉18g/L。
[0015]另一方面，本专利技术涉及一种欧文氏菌CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统，所述欧文氏菌CRISPR
‑
Cas9基因编辑系统用于定向敲除欧文氏菌Erwiniasp.QL
‑
Z3的漆酶ELAC_205基因，其包括：敲除ELAC_205基因的上游同源臂的引物、敲除ELAC_205基因的下游同源臂的引物和sgRNA；所述敲除ELAC_205基因的上游同源臂的引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游同源臂F1端引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的上游同源臂R1端引物；所述敲除ELAC_205基因的下游同源臂的引物包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种欧文氏菌中漆酶基因敲除的方法，其特征在于，包括：敲除ELAC_205基因的上游同源臂，敲除ELAC_205基因的下游同源臂和sgRNA；所述敲除ELAC_205基因的上游同源臂的引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的上游同源臂F1端引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的上游同源臂R1端引物；所述敲除ELAC_205基因的下游同源臂的引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的下游同源臂F2端引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的下游同源臂R2端引物；所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；在欧文氏菌Erwinia sp.QL
‑
Z3中定向敲除漆酶ELAC_205基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用质粒pCas和质粒pTargetF在欧文氏菌Erwinia sp.QL
‑
Z3中定向敲除漆酶ELAC_205基因。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述质粒pCas电化学转化进入欧文氏菌Erwinia sp.QL
‑
Z3中；将插入了敲除ELAC_205基因的上游同源臂的引物、敲除ELAC_205基因的下游同源臂的引物和sgRNA的重组质粒pTargetF转化浸入含pCas的欧文氏菌Erwinia sp.QL
‑
Z3中，完成基因敲除，得到导入了双质粒的欧文氏菌
‑
pCas
‑
pTargetF菌株；将所述欧文氏菌
‑
pCas
‑
pTargetF菌株依次进行质粒pTargetF的消除和质粒pCas消除，得到定向敲除了欧文氏菌Erwinia sp.QL
‑
Z3中漆酶ELAC_205基因的菌种。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述质粒pCas电化学转化包括：制备欧文氏菌Erwinia sp.QL
‑
Z3的感受态细胞，加入3~5
µ
L pCas质粒，冰上静置20min，1.5 KV电激，冰浴3min，加入700μL LB液体培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫亚红，黄丽丽，谭涛，赵姝婷，邓东涛，邓磊，田乾易，冯洁，
申请(专利权)人：西北农林科技大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：