【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种高效介导外源基因整合的质粒系统及其应用。
技术介绍
1、盐单胞菌(halomonas)是一种研究聚羟基脂肪酸酯(pha)合成的重要微生物，是工业化生产pha的优势底盘。目前用于盐单胞菌的基因编辑技术手段主要有两种：一种是以自杀质粒为载体的同源重组方法，另一种方法是基于crispr/cas9的基因编辑方法。上述两种方法都依赖同源重组，而同源重组依赖同源区域或序列的存在，且产生的dna链断裂是随机的，因此会限制外源dna序列的长度，此外还需要通过优化同源臂的长度和对应dna序列的位置，才能达到比较好的基因编辑效果。与之相比，位点特异性重组不依赖于同源重组，而依赖于能与某些酶相结合的短dna序列，在这些高效特异的重组酶的作用下，发生dna链的断裂和重新连接。因而具有位点特异性，保证了重组的高度专一性和高度保守性。
2、位点特异性重组系统来源于噬菌体，噬菌体在侵染细菌时会将其dna插入到宿主细菌的染色体上，并和宿主同步复制分裂，这一过程需要噬菌体体内的位点特异性重组酶识别专门的“识别位点”—“attp”和“attb”(attp和attb分别存在于噬菌体和宿主染色体中)。重组酶介导attp和attb两个序列之间的重组，这一过程会将噬菌体dna插入到宿主细菌染色体上，原有的attp和attb序列会在染色体上形成两个新的序列“attl”和“attr”。作为工具，位点特异性重组系统由整合酶的识别位点/序列和识别dna序列并介导dna重组的整合酶组成。通过改变重组酶识别位点的位置和序列方向，位点特异性重
3、重组工程在许多情况下仅有3～4kb的有效载荷大小限制，使得其对高通量dna盒的基因组整合用处较小。最后，对宿主特异性因子的未知要求或噬菌体重组蛋白的跨物种不相容使得大肠杆菌重组工程系统对适应其他细菌物种有挑战性，因此利用不同的菌株进行基因整合时，需要优化或筛选新的重组酶。
技术实现思路
1、针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种高效介导外源基因整合的质粒系统及其应用。
2、本专利技术提供了一种高效介导外源基因整合的质粒系统，所述质粒系统包括：
3、(1)第一质粒，所述第一质粒包含整合重组酶的attp核苷酸序列；
4、(2)第二质粒，所述第二质粒包含整合重组酶的attb核苷酸序列；
5、(3)第三质粒，所述第三质粒包含切除重组酶的核苷酸序列；
6、其中，(1)、(2)中所述整合重组酶为int5、int7、bxb1、int12中的任意一种；int5的核苷酸序列如seq id no.75所示，int7的核苷酸序列如seq id no.76所示，bxb1的核苷酸序列如seq id no.77所示，int12的核苷酸序列如seq id no.78所示；
7、(3)中所述切除重组酶为scre、vcre、dre、flp中的任意一种；
8、其中，scre的核苷酸序列如seq id no.68所示，vcre的核苷酸序列如seq idno.69所示，dre的核苷酸序列如seq id no.70所示，flp的核苷酸序列如seq id no.71所示。
9、进一步的，所述int5的attp核苷酸序列如seq id no.59所示，所述int7的attp核苷酸序列如seq id no.61所示，所述bxb1的attp核苷酸序列如seq id no.63所示，所述int12的attp核苷酸序列如seq id no.65所示；
10、所述int5的attb核苷酸序列如seq id no.60所示，所述int7的attb核苷酸序列如seq id no.62所示，所述bxb1的attb核苷酸序列如seq id no.64所示，所述int12的attb核苷酸序列如seq id no.66所示。
11、进一步的，所述第一质粒由pre112质粒构建获得；和/或所述第二质粒由pseva321质粒构建获得；和/或所述第三质粒由pseva341质粒构建获得。
12、进一步的，所述第一质粒和/或第二质粒和/或第三质粒还包含启动子，所述启动子为porin68、porin58、porin141、j23115、j23106、j23101中的任意一种或多种。
13、本专利技术还提供一种在菌株中整合外源基因的方法，包括如下步骤：
14、(i)将权利要求1所述第一质粒整合到菌株的基因组中；
15、(ii)将外源基因的核苷酸序列整合到所述第二质粒中，并将第二质粒导入(i)所述菌株中；
16、(iii)将权利要求1所述第三质粒导入(i)所述菌株中。
17、进一步的，(i)所述菌株为盐单胞菌。
18、进一步的，(i)所述第一质粒的整合方法为同源重组。
19、本专利技术还提供一种工程菌，包括所述的质粒系统。
20、进一步的，所述工程菌为盐单胞菌。
21、本专利技术还提供所述的质粒系统或所述的工程菌在基因编辑中的应用。
22、综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
23、1、本专利技术的质粒系统能够在菌株中整合不同序列长度以及不同表达强度的外源基因，基因整合效率高达100％。
24、2、本专利技术的质粒系统能有效的提高构建各类稳定表达菌株的效率，实现各种模型的高效构建，能广泛应用于不同底盘微生物中，进行基因编辑操作。
25、3、本专利技术质粒系统构建方法及外源基因整合的操作方法简单、价格低廉，普通的实验室可自行完成构建。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高效介导外源基因整合的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括：
2.根据权利要求1所述质粒的系统，其特征在于，所述int5的attP核苷酸序列如SEQ IDNO.59所示，所述int7的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.61所示，所述bxb1的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.63所示，所述int12的attP核苷酸序列如SEQ ID NO.65所示；
3.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述第一质粒由pRE112质粒构建获得；
4.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述第一质粒和/或第二质粒和/或第三质粒还包含启动子，所述启动子为Porin68、Porin58、Porin141、J23115、J23106、J23101中的任意一个或多个。
5.一种在菌株中整合外源基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，(i)所述菌株为盐单胞菌。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，(i)所述第一质粒的整合方法为同源重组。
8.
9.根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为盐单胞菌。
10.权利要求1～4任一项所述的质粒系统或权利要求8～9任一项所述的工程菌在基因编辑中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高效介导外源基因整合的质粒系统，其特征在于，所述质粒系统包括：
2.根据权利要求1所述质粒的系统，其特征在于，所述int5的attp核苷酸序列如seq idno.59所示，所述int7的attp核苷酸序列如seq id no.61所示，所述bxb1的attp核苷酸序列如seq id no.63所示，所述int12的attp核苷酸序列如seq id no.65所示；
3.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述第一质粒由pre112质粒构建获得；
4.根据权利要求1所述的质粒系统，其特征在于，所述第一质粒和/或第二质粒和/或第三质粒还包含启动子，所述启动子为por...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶健文，林艺娜，邓怡豪，吕金艳，司徒卫，余柳松，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。