一种大肠杆菌联产苯丙酸与肉桂醇的方法技术

一种大肠杆菌联产苯丙酸与肉桂醇的方法，通过向两株原始或改造过的大肠杆菌中导入途径中不同的基因来实现苯丙酸和肉桂醇的联合生产，一株通过向大肠杆菌中导入一条表达酪氨酸解氨酶，烯酸还原酶生产苯丙酸的途径，另一株菌为通过向大肠杆菌中中导入肉桂酰辅酶A还原酶，醇脱氢酶，香豆酰辅酶A连接酶，全细胞催化肉桂酸合成肉桂醇，并通过选择合适的共培养两株菌的培养条件提高了产量。本发明专利技术能够实现苯丙酸和肉桂醇的联产，减少中间产物的合成，同时培养基成分简单利于后续处理，从而有利于降低生产成本。降低生产成本。降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌联产苯丙酸与肉桂醇的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种大肠杆菌联产苯丙酸与肉桂醇的方法。

技术介绍

[0002]苯丙酸常用作香料或添加于调味品中，也应用于医药领域。肉桂醇因其香气和特性成为一种用途广泛的化学品，用于香料和调味品行业，用来形成肉桂香调和相似的水果香气。它也可以用作生产有香气的酯的中间体、用于合成紫杉醇的C13侧链、合成抗生素和抗抑郁药瑞波西汀甲磺酸盐。目前苯丙酸和肉桂醇的生产依赖化学法，通常以肉桂酸为前体，成本较高，且产物分离困难，并且对环境不友好。同时苯丙酸和肉桂醇都是肉桂酸的衍生物，但在同时合成两者时存在中间产物。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供联产苯丙酸和肉桂醇的共培养的两株菌，一株通过向大肠杆菌中导入一条表达酪氨酸解氨酶，烯酸还原酶生产苯丙酸的途径，另一株菌为通过向大肠杆菌中中导入肉桂酰辅酶A还原酶，醇脱氢酶，香豆酰辅酶A连接酶，全细胞催化肉桂酸合成肉桂醇。
[0004]本专利技术的又一目的是提供一种共培养的方法，通过向两株原始或改造过的大肠杆菌中导入途径中不同的基因来实现苯丙酸和肉桂醇的联合生产，并通过优化共培养两株菌的培养条件提高产量。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0006]一种大肠杆菌联产苯丙酸与肉桂醇的方法，包括：
[0007]向一株大肠杆菌中导入导入酪氨酸解氨酶(TAL)、烯酸还原酶(ER)的相应基因，向另一株大肠杆菌中中导入香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)的相应基因，之后共培养两株大肠杆菌获得苯丙酸和肉桂醇。
[0008]进一步的，包括步骤：
[0009](1)向大肠杆菌一中导入酪氨酸解氨酶(TAL)，烯酸还原酶(ER)的相应基因，从发酵液中取样，利用高效液相色谱对产物浓度进行分析；
[0010](2)向大肠杆菌二中导入香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)的相应基因，体外添加肉桂酸，从发酵液中取样，测OD并利用高效液相色谱对产物浓度进行分析。
[0011](3)分别将产苯丙酸的菌株和产肉桂醇的菌株过夜培养之后，转接合适的培养基中，在合适的温度下培养一段时间，之后将两种培养基混合进行混合培养。
[0012]进一步的，所述步骤(1)包括：
[0013]通过PCR方法从相应基因组获得片段，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切，回收将酶切后的片段，之后将目的基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
‑
luc上，获得pZE
‑
TAL
‑
ER重组质粒；
[0014]取构建好的质粒pZE
‑
TAL
‑
ER，通过化学转化法转入大肠杆菌中；之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养；将转化有质粒pZE
‑
TAL
‑
ER的大肠杆菌，定义菌株为EC1，在EC1的平板上挑取单菌落，在带有相应抗性的液体LB中，过夜培养；之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性培养基中，在温度37℃条件下进行振荡培养；当OD
600
值为0.6时，加入IPTG进行诱导。
[0015]进一步的，所述步骤(2)包括：
[0016]通过PCR方法从相应基因组获得片段，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切，回收将酶切后的片段，之后将目的基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
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luc上，获得pZE
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4CL
‑
CCR
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ADH重组质粒；取构建好的质粒pZE
‑
4CL
‑
CCR
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ADH，通过化学转化法转入大肠杆菌中；之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养；将转化有质粒pZE
‑
TAL
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ER的大肠杆菌，定义菌株为EC2，在EC2的平板上挑取单菌落，在带有相应抗性的液体LB中，过夜培养；之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性培养基中，在温度37℃条件下进行振荡培养；当OD
600
值为0.6时，加入IPTG进行诱导。
[0017]进一步的，所述步骤(3)包括：
[0018]分别将产苯丙酸的菌株和产肉桂醇的菌株过夜培养之后，转接合适的培养基中，在合适的温度下培养一段时间，之后将两种培养基混合培养。
[0019]进一步的，所述步骤(3)包括：
[0020]分别将产苯丙酸的菌株和产肉桂醇的菌株过夜培养之后，转接合适的培养基中，在合适的温度下培养36h，之后将两种培养基混合培养。
[0021]进一步的，所述步骤(3)包括：
[0022]分别将产苯丙酸的菌株和产肉桂醇的菌株过夜培养之后，转接合适的培养基中，在合适的温度下培养产苯丙酸的菌株36h，培养产肉桂醇的菌株24h，之后将两种培养基混合培养。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果：
[0024]本专利技术通过引入异源代谢途径酶的表达，选用改造过的大肠杆菌作为宿主细胞，通过二步发酵法最终实现苯丙酸和肉桂醇的共同生产，实验结果表明，苯丙酸和肉桂醇的最终产量分别为341.54mg/L和119.49mg/L。
附图说明
[0025]图1是具体实施例1，大肠杆菌导入酪氨酸解氨酶(TAL)和烯酸还原酶(ER)基因，在摇瓶反应器中发酵生产苯丙酸的结果。
[0026]图2是具体实施例2，大肠杆菌导入香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和醇脱氢酶(ADH)，在摇瓶反应器中添加肉桂酸后全细胞催化生产肉桂醇的结果。
[0027]图3是具体实施例3，共培养实施例1和2菌株，摇瓶反应器中联产苯丙酸和肉桂醇的发酵结果。
[0028]图4是具体实施例4，共培养实施例1和2菌株，对发酵条件进行优化后摇瓶反应器中联产苯丙酸和肉桂醇的发酵结果。
具体实施方式：
[0029]下面将结合附图和具体实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]具体实施例1
[0031]从碳源起始合成苯丙酸
[0032]本实施例中大肠杆菌导入酪氨酸解氨酶(TAL)和烯酸还原酶(ER)基因，在摇瓶反应器中从头合成发酵生产苯丙酸。
[0033]具体方法为通过PCR方法从相应基因组获得片段，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切，回收将酶切后的片段，之后将目的基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
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luc上，获得pZE
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TAL
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ER重组质粒。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌联产苯丙酸与肉桂醇的方法，其特征在于，包括：向一株大肠杆菌中导入导入酪氨酸解氨酶(TAL)、烯酸还原酶(ER)的相应基因，向另一株大肠杆菌中中导入香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)的相应基因，之后共培养两株大肠杆菌获得苯丙酸和肉桂醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括步骤：(1)向大肠杆菌一中导入酪氨酸解氨酶(TAL)，烯酸还原酶(ER)的相应基因，从发酵液中取样，利用高效液相色谱对产物浓度进行分析；(2)向大肠杆菌二中导入香豆酰辅酶A连接酶(4CL)，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)，醇脱氢酶(ADH)的相应基因，体外添加肉桂酸，从发酵液中取样，测OD并利用高效液相色谱对产物浓度进行分析。(3)分别将产苯丙酸的菌株和产肉桂醇的菌株过夜培养之后，转接合适的培养基中，在合适的温度下培养一段时间，之后将两种培养基混合进行混合培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：通过PCR方法从相应基因组获得片段，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切，回收将酶切后的片段，之后将目的基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
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luc上，获得pZE
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TAL
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ER重组质粒；取构建好的质粒pZE
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TAL
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ER，通过化学转化法转入大肠杆菌中；之后取适量菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃过夜培养；将转化有质粒pZE
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TAL
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ER的大肠杆菌，定义菌株为EC1，在EC1的平板上挑取单菌落，在带有相应抗性的液体LB中，过夜培养；之后将菌液转接到20mL的带有相应抗性培养基中，在温度37℃条件下进行振荡培养；当OD
60...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙婧，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：