一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法与应用，属于动物病毒学与基因工程学领域，包括以下步骤：将PEDV基因组序列分为A、B、C、D、E和F片段；用sgRNA

【技术实现步骤摘要】
一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法与应用


[0001]本专利技术属于动物病毒学与基因工程学
，尤其涉及一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法与应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一种肠道冠状病毒，主要引起新生仔猪的呕吐、腹泻、脱水和死亡。1971年，英国首次报道了PEDV的出现，之后欧洲多个国家也陆续报道了猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)的发生。我国于上世纪80年代初首次发生PED。2010年10月底以来，由PEDV变异毒株引起的仔猪腹泻在我国大面积暴发，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。随后美国、加拿大、韩国、越南、泰国等国家也相继出现了PEDV变异毒株的流行，严重制约了世界养猪业的健康发展。
[0003]由于PEDV毒株的不断变异，导致已有的PEDV商品化疫苗的临床应用效果受到一定的影响，快速、高效构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒及重组病毒方法的建立，可以实现对PEDV的快速改造，从而获得针对性更强、更广谱的疫苗毒株，对有效预防PEDV的感染与流行及研究PEDV各编码基因的功能具有重要意义。
[0004]目前，已有利用限制性酶切位点构建PEDV感染性cDNA质粒方法的报道，但该方法不仅受基因组中酶切位点的限制，且连接和切割效率低。CRISPR/Cas9技术是近几年发展起来的一种新的基因编辑技术，不受限制性内切酶切割位点的限制，因此连接位点的选择更加灵活，只需要有NGG切割位点即可，再利用同源重组酶将目的片段与切割的载体进行同源重组即可获得目的质粒。利用该方法可以快速获得精准编辑的毒株，同时该方法还具有操作简单、效率高等突出优点。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法与应用，构建的质粒可以直接转染细胞获得病毒，不需要再转辅助质粒，该方法操作简单、获得感染性cDNA质粒的效率高。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法，包括以下步骤：
[0008]将PEDVAJ1102株第90代毒(AJ1102
‑
F90R)基因组序列分为6个片段，即A、B、C、D、E和F，所述A、B、C、D、E和F分别为PEDVAJ1102
‑
F90R基因组序列的第278～5593位、第5573～10855位、第10836～16040位、第16020～20779位、第20760～24090位和第24070～27710位的基因序列；
[0009]基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得sgRNA
‑
A、sgRNA
‑
C、sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M，所述sgRNA
‑
A、sgRNA
‑
C、sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M的转录模板序列分别如SEQ ID NO:13～16所示，经体外转录获得sgRNA
‑
A、sgRNA
‑
C、sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M；
[0010]用sgRNA
‑
A对质粒pBAC
‑
M线性化，将A、B片段与线性化的pBAC
‑
M质粒同源重组，获得质粒pBAC
‑
M
‑
AB；
[0011]用sgRNA
‑
C对质粒pBAC
‑
M
‑
AB线性化，将C、D片段与线性化的pBAC
‑
M
‑
AB质粒同源重组，获得质粒pBAC
‑
M
‑
ABCD；
[0012]用sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M对质粒pBAC
‑
M
‑
ABCD线性化，将E、F片段与线性化的pBAC
‑
M
‑
ABCD质粒同源重组获得PEDV全长质粒，命名为pBAC
‑
AJ1102
‑
F90R，即得猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒。
[0013]优选的，所述质粒pBAC
‑
M为将含CMV启动子序列、PEDV5
’‑
UTR序列、PEDV3
’‑
UTR序列和polyA(28)、HDVr自切割位点序列、BGH(polyA)转录终止信号序列的片段与线性化的pBeloBAC11片段重组，获得质粒pBAC
‑
M。
[0014]本专利技术还提供了一种根据上述方法构建得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒。
[0015]本专利技术还提供了一种猪流行性腹泻病毒rAJ1102
‑
F90R株，所述PEDV rAJ1102
‑
F90R株是将上述cDNA质粒转化至DH10B化学感受态细胞，得到pBAC
‑
AJ1102
‑
F90R阳性克隆，将阳性克隆扩大培养后，大量提取质粒pBAC
‑
AJ1102
‑
F90R，转染Vero细胞即得。
[0016]本专利技术还提供了一种上述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒或PEDV rAJ1102
‑
F90R株在制备猪流行性腹泻疫苗中的应用。
[0017]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0018]本专利技术提供了一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法与应用，本专利技术采用CRISPR/Cas9技术，对质粒进行切割，不受限制性内切酶切割位点的限制，因此连接位点的选择更灵活，只需要有切割位点NGG即可，构建更为简便。同时本专利技术将PEDV基因基均分为6段，每次同源重组2个片段，连接效率更高。本专利技术构建的质粒可以直接转染细胞获得病毒，不需要再转辅助质粒，降低了成本。
附图说明
[0019]图1：猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒pBAC
‑
AJ1102
‑
F90R的构建示意图；
[0020]图2：pBAC
‑
AJ1102
‑
F90R限制性内切酶酶切图谱及NcoI酶切电泳图；
[0021]图3：AJ1102
‑
F90R株和rAJ1102
‑
F90R株感染Vero细胞引起的细胞病变；
[0022]图4：AJ1102
‑
F90R株和rAJ1102
‑
F90R株感染Ver本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建猪流行性腹泻病毒感染性cDNA质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：将PEDVAJ1102株第90代毒(AJ1102
‑
F90R)基因组序列分为6个片段，即A、B、C、D、E和F，所述A、B、C、D、E和F分别为PEDVAJ1102
‑
F90R株基因组序列的第278～5593位、第5573～10855位、第10836～16040位、第16020～20779位、第20760～24090位和第24070～27710位的基因序列；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，获得sgRNA
‑
A、sgRNA
‑
C、sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M，所述sgRNA
‑
A、sgRNA
‑
C、sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M的转录模板序列分别如SEQ ID NO:13～16所示，经体外转录获得sgRNA
‑
A、sgRNA
‑
C、sgRNA
‑
E和sgRNA
‑
M；用sgRNA
‑
A对质粒pBAC
‑
M线性化，将A、B片段与线性化的pBAC
‑
M质粒同源重组，获得质粒pBAC
‑
M
‑
AB；用sgRNA
‑
C对质粒pBAC
‑
M
‑
AB线性化，将C、D片段与线性化的pBAC
‑
M
‑
AB质粒同源重组，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖少波，李明翔，方六荣，张益野，周艳荣，方谱县，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：