哺乳动物细胞表面展示质粒、细胞系及抗体检测方法、高产抗体细胞株的检测方法及应用技术

本发明专利技术提供了哺乳动物细胞表面展示质粒、细胞系及抗体检测方法、高产抗体细胞株的检测方法及应用，本发明专利技术将蛋白分泌信号肽、抗体Fc片段结合肽Z或ZZ和跨膜结构域组装，构建哺乳动物细胞表面展示ZZ质粒。将哺乳动物细胞表面展示ZZ质粒转染进哺乳动物细胞，运用荧光标记技术和流式细胞分选技术，经过数轮分选后，获得高效展示ZZ的稳定哺乳动物细胞系统。利用高效展示ZZ的细胞进行抗体的鉴定和定量，同时，运用该细胞进行高产品质抗体的细胞克隆株的筛选和性能鉴定。这一方法简单便捷，适用于人源、兔源和驴源等多个物种的IgG抗体。因此，本方法具有较广泛的应用性。方法具有较广泛的应用性。方法具有较广泛的应用性。

【技术实现步骤摘要】
哺乳动物细胞表面展示质粒、细胞系及抗体检测方法、高产抗体细胞株的检测方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及哺乳动物细胞表面展示质粒、细胞系及抗体检测方法、高产抗体细胞株的检测方法及应用。

技术介绍

[0002]抗体已经成为医药市场上最畅销的药物，全球抗体药物市场连续8年保持10％以上的增速，并于2021年突破2000亿美元，抗体药物的研发和生产处于高速增长期。
[0003]在抗体药物的研发过程中，稳定的高产细胞株筛选和鉴定是非常关键的一步。在抗体的生产过程中，细胞株退化严重影响抗体的质量和产量，维持抗体生产细胞的性能和其克隆原性对抗体的质量和品质十分重要。高产细胞株鉴定和验证是抗体药物研发和生产的必要工作。
[0004]高产单克隆细胞株性能的鉴定包括产量、效价、亲和力、活性、抗体聚体、稳定性和生长稳定性等。比蚀法、蛋白定量法、酶联免疫吸附法(enzyme
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linked immunosorbent assay，ELISA)、质谱法、高效液相色谱及表面等离子体共振等是常用的高产细胞株的鉴定方法。比蚀法和蛋白定量法简单成本低，但检测的是细胞分泌的所有蛋白，灵敏度低、专一性和准确性低；ELISA法操作复杂时间长且成本较高；质谱法、高效液相色谱法及表面等离子共振法需要大型的仪器设备，且通量和效率低。此外，以上检测方法均在非生理反应条件下进行，检测过程中抗体需要暴露于各自的缓冲液中，影响抗体的活性，无法进行高产活性抗体单克隆株的筛选和鉴定。因此，开发分泌活性抗体的克隆株的筛选和鉴定方法，将有助于抗体药物的开发。
[0005]目前已报道出多种可以结合抗体的多肽，并应用于抗体的纯化中(Gong et al.2016；Sun et al.2018；Wei et al.2015)。来自的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A(staphylococcal protein A,SpA)的B结构域可以识别IgG的Fc片段，且不干扰抗体与抗原的结合。根据B结构域合成的多肽常被称为Z结构域(Nord et al.1995；Pham et al.2019)，常被用于生物学和抗体纯化研究中。细胞表面展示技术将目的蛋白表达在细胞外膜，可以在生理条件下研究蛋白与基配体的相互作用，已广泛应用于抗体工程、糖代谢工程及蛋白表达等领域(Chen et al.2012；Ying et al.2022)。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供哺乳动物细胞表面展示质粒、细胞系，本专利技术将蛋白分泌信号肽(Serum albumin preproprotein，human Igκchain等)、抗体Fc片段结合肽Z或ZZ和跨膜结构域(transmembrane,TM；包括PDGFR和B7.1等)组装，构建哺乳动物细胞表面展示ZZ质粒。将哺乳动物细胞表面展示ZZ质粒转染进哺乳动物细胞，运用荧光标记技术和流式细胞分选技术，经过数轮分选后，获得高效展示ZZ的稳定哺乳动物细胞系统。
[0007]本专利技术还提供了抗体检测方法、高产抗体细胞株的检测方法及应用，采用已知浓
度的标准抗体对高效展示ZZ的稳定的哺乳动物细胞进行检测，建立抗体浓度
‑
荧光的标准曲线，并拟合标准方程，根据标准方程，对未知浓度抗体进行定量检测。收获抗体分泌细胞克隆的培养基，直接标记高效展示ZZ的稳定的哺乳动物细胞，再运用流式细胞术对抗体标记上的阳性细胞进行检测，以阳性细胞的占比为标准，筛选高效分泌高活性抗体的细胞克隆，实现高产抗体细胞株的检测。
[0008]本专利技术还提供了以上高产抗体细胞株的检测方法用于制备抗体药物的应用。
[0009]本专利技术具体技术方案如下：
[0010]哺乳动物细胞表面展示质粒，包括蛋白分泌信号肽(BM40，Azurocidin preproprotein，Serum albumin preproprotein和human Igκchain)、抗体Fc片段结合肽Z或ZZ和跨膜结构域(transmembrane,TM；包括PDGFR和B7.1)。ZZ是指两个串联的Z，抗体结合效率高。
[0011]优选的，以pUHD 10
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3为载体，合成包含有信号肽、Fc结合肽(Z或ZZ)以及跨膜结构域的基因序列，用EcoRI/XbaI酶切插入，获得pUHD
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Z
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dis或pUHD
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ZZ
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dis质粒。
[0012]或，以pcDNA
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I
‑
W
‑
2a
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GFP为载体，用XbaI/SalI酶切插入合成的包含信号肽、标签、Fc结合肽(Z或ZZ)以及跨膜结构域的基因序列，获得pSPsaST1ZB7或pSPsaST1ZZB7质粒。
[0013]本专利技术提供的哺乳动物细胞表面展示的细胞系，将哺乳动物细胞表面展示质粒转染进哺乳动物细胞获得。
[0014]优选的，转染后，运用荧光标记技术和流式细胞分选技术，经过7轮分选后，获得高效展示ZZ的稳定哺乳动物细胞。
[0015]优选的，将上述质粒转染进CHO细胞，利用hIgG
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FITC进行荧光标记，运用流式细胞分选，获得稳定高效展示Fc结合肽ZZ的细胞CHO
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ZZ。该细胞系对人源、兔源和驴源多个物种的IgG抗体有高效的结合。
[0016]所述哺乳动物包括人、兔、驴、羊或鼠。
[0017]本专利技术提供的抗体检测方法，具体为：用已知浓度的标准抗体对高效展示ZZ的稳定的哺乳动物细胞进行检测，建立抗体浓度
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荧光的标准曲线，并拟合标准方程，根据标准方程，对未知浓度抗体进行定量检测。
[0018]优选的，基于CHO
‑
ZZ细胞的生理条件下活性抗体定量的方法，利用已知浓度的标准抗体进行系列浓度的标记，建立荧光
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剂量的标准曲线，并拟合二元一次方程，在相同条件下用未知浓度的抗体标记细胞，流式细胞仪检测的荧光值根据方程计算得到抗体浓度。
[0019]本专利技术提供的高产抗体细胞株的检测方法，具体为：收获抗体分泌细胞克隆的培养基，直接标记高效展示ZZ的稳定的哺乳动物细胞，再运用流式细胞术对抗体标记上的阳性细胞进行检测，以阳性细胞的占比为标准，筛选高效分泌高活性抗体的细胞克隆。
[0020]优选的，获得不同细胞克隆的培养基，直接标记CHO
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ZZ细胞；采用带荧光抗原二次标记，即可根据检测CHO
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ZZ细胞阳性细胞数进行高产活性抗体细胞克隆的检测和筛选。
[0021]本专利技术提供的以上高产抗体细胞系的检测方法的应用，用于制备抗体药物的应用。通过以上方法，能够获得筛选出高产活性抗体细胞，用于抗体药物制备，更高效、稳定。
[0022]本专利技术将两个串连的Z多肽展示在CHO细胞表面，通过流式细胞分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.哺乳动物细胞表面展示质粒，其特征在于，所述哺乳动物细胞表面展示质粒包括：蛋白分泌信号肽、抗体Fc片段结合肽Z或ZZ和跨膜结构域。2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表面展示质粒，其特征在于，所述蛋白分泌信号肽为信号肽BM40，信号肽Azurocidin preproprotein，信号肽Serum albumin preproprotein或信号肽human Igκchain。3.根据权利要求1或2所述的哺乳动物细胞表面展示质粒，其特征在于，所述哺乳动物细胞表面展示质粒为：以pUHD 10
‑
3为载体，合成包含有信号肽、Fc结合肽(Z或ZZ)以及跨膜结构域的基因序列，用EcoRI/XbaI酶切插入，获得pUHD
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Z
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dis或pUHD
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ZZ
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dis质粒。4.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表面展示质粒，其特征在于，所述哺乳动物细胞表面展示质粒为：以pcDNA
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I
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W
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2a
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GFP为载体，用XbaI/SalI酶切插入合成的包含信号肽、标签、Fc结合肽以及跨膜结构域的...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍凌志，潘家洁，杨爱珍，马洁，赵国平，陈少鹏，
申请(专利权)人：皖南医学院，
类型：发明
国别省市：