【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诱导产生RAAV病毒粒子的稳定细胞系
1.相关申请的交叉引用
[0001]本专利申请要求2020年7月30日提交的第63/058887号、第63/058894号和第63/058900号，2021年3月3日提交的第63/156230号、第63/156207号和第63/156239号，以及2021年6月30日提交的第63/216615号美国临时专利申请的利益和优先权。上述引用各申请各自内容在此通过专门引用以其整体并入。2.专利技术背景
[0002]重组腺相关病毒(rAAV)是基因导入体内基因导入的首选载体。AAV不存在已知的疾病关联，可感染分裂和未分裂细胞(罕见于将其整合入哺乳动物细胞基因组中时)，并且基本上可以作为一种转录活性核游离基因在被感染细胞的一生中持续存在。美国食品和药物管理局(FDA)最近批准了几种rAAV基因治疗产品，许多其他基于rAAV的基因治疗和基因编辑产品正在研发中。
[0003]最常用的rAAV病毒粒子生产方法是在无辅助病毒的条件下将多个质粒瞬时转染至贴壁细胞系(通常是三重转染)。尽管在通过持续投资来提高生产能力，但...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种由以下部分组成的细胞：a)编码AAV Rep蛋白和AAV Cap蛋白的第一个多核苷酸构建体；b)编码一个或多个腺病毒辅助蛋白的第二个多核苷酸构建体；其中，当一个或多个核酸整合至哺乳动物细胞的核基因组中时，可有条件地表达AAV Rep蛋白、AAV Cap蛋白和/或一个或多个腺病毒辅助蛋白，从而有条件地产生重组AAV(rAAV)病毒粒子。2.权利要求1所述的细胞，其中，第二个多核苷酸构建体包含以下编码序列：a)一个或多个辅助蛋白；b)位于一个或多个辅助蛋白上游的自激发元件；以及c)位于自切元件上游的诱导型启动子。3.权利要求2所述的细胞，其中，通过操纵将自切元件连接至诱导型启动子。4.权利要求2或3所述的细胞，其中，自切元件的表达是由诱导型启动子驱动的。5.权利要求2
‑
4中任一项所述的细胞，其中，诱导型启动子是四环素反应性启动子元件(TRE)。6.权利要求5所述的细胞，其中，TRE包含与最小启动子融合的Tet操纵子(tetO)序列多联体。7.权利要求6所述的细胞，其中，最小启动子是人巨细胞病毒启动子。8.权利要求3
‑
7中任一项所述的细胞，其中，诱导型启动子包含与SEQ ID NO:22具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。9.权利要求3
‑
8中任一项所述的细胞，其中，在与激活剂结合后，将从诱导型启动子中激活转录过程。10.权利要求9所述的细胞，其中，当存在第一触发剂时，激活剂与诱导型启动子结合。11.权利要求1
‑
10中任一项所述的细胞，其中，第二个多核苷酸构建体进一步包含激活剂编码序列。12.权利要求9
‑
11中任一项所述的细胞，其中，可通过操纵将激活剂连接至组成型启动子。13.权利要求12所述的细胞，其中，组成型启动子是E1α启动子或人巨细胞病毒启动子。14.权利要求13所述的细胞，其中，E1α启动子包含至少一个突变。15.权利要求12
‑
14中任一项所述的细胞，其中，组成型启动子包含与SEQ ID NO:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。16.权利要求9
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15中任一项所述的细胞，其中，激活剂是反向四环素控制性反式激活子(rTA)，包含与VP16转导结构域融合的Tet Repressor结合蛋白(TetR)。17.权利要求16所述的细胞，其中，rTA包含tetR DNA结合部分中的四个突变。18.权利要求16或17所述的细胞，其中，rTA包含一个与SEQ ID NO:21具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。19.权利要求2
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4中任一项所述的细胞，其中，诱导型启动子是一个cumate操纵子序列。20.权利要求19所述的细胞，其中，cumate操纵子序列位于组成型启动子的下游。21.权利要求20所述的细胞，其中，组成型启动子是人巨细胞病毒启动子。22.权利要求19
‑
21中任一项所述的细胞，其中，当不存在第一触发剂时，诱导型启动子
与cymR阻遏物结合。23.权利要求19
‑
22中任一项所述的细胞，其中，当存在第一触发剂时，诱导型启动子将会被激活。24.权利要求23所述的细胞，其中，第一触发剂与cymR阻遏物结合。25.权利要求19
‑
24中任一项所述的细胞，进一步包含一个cymR阻遏物。26.权利要求25所述的细胞，其中，可通过操纵将cymR阻遏物连接至组成型启动子。27.权利要求26所述的细胞，其中，组成型启动子是E1α启动子。28.权利要求27所述的细胞，其中，E1α启动子包含至少一个突变。29.权利要求20
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28中任一项所述的细胞，其中，组成型启动子包含与SEQ ID NO:20具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。30.权利要求19
‑
29中任一项所述的细胞，其中，第一触发剂是一种cumate。31.权利要求2
‑
30中任一项所述的细胞，其中，自切元件编码序列包含一个polyA序列。32.权利要求2
‑
31中任一项所述的细胞，其中，自切元件是一种重组酶。33.权利要求32所述的细胞，其中，重组酶与配体结合域融合。34.权利要求32或33所述的细胞，其中，重组酶是Cre多肽或翻转酶多肽。35.权利要求34所述的细胞，其中，Cre多肽与配体结合域融合。36.权利要求35所述的细胞，其中，配体结合结构域是一种激素受体。37.权利要求36所述的细胞，其中，重组酶是Cre
‑
ERT2多肽。38.权利要求32
‑
37中任一项所述的细胞，其中，当存在第二触发剂时，自切元件将易位至细胞核。39.权利要求38所述的细胞，其中，第二触发剂是一种雌激素受体配体。40.权利要求38或39所述的细胞，其中，第二触发剂是一种选择性雌激素受体调节剂(SERM)。41.权利要求40所述的细胞，其中，第二触发剂是他莫昔芬。42.权利要求32
‑
41中任一项所述的细胞，其中，重组酶的两侧是重组位点。43.权利要求42所述的细胞，其中，重组位点是Lox位点或翻转酶识别靶点(FRT)。44.权利要求43所述的细胞，其中，Lox位点是loxP位点。45.权利要求1
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44中任一项所述的细胞，其中，一个或多个腺病毒辅助蛋白包含E2A和E4。46.权利要求45所述的细胞，其中，E2A是FLAG标记的E2A。47.权利要求45或46所述的细胞，其中，E2A编码序列和E4编码序列被内部核糖体进入位点(IRES)或P2A分隔开。48.权利要求1
‑
47中任一项所述的细胞，进一步包含可选标记物编码序列。49.权利要求48所述的细胞，其中，可选标记物是抗生素抗性蛋白。50.权利要求49所述的细胞，其中，可选标记物是与抗生素抗性蛋白的N端或C端相连的断裂蛋白质内含子。51.权利要求49或50所述的细胞，其中，抗生素抗性蛋白用于赋予嘌呤霉素抗性或杀稻瘟菌素抗性。
52.权利要求1
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51中任一项所述的细胞，其中，第二个多核苷酸构建体进一步包含VARNA编码序列。53.权利要求52所述的细胞，其中，VA RNA编码序列是一个转录死亡序列。54.权利要求52或53所述的细胞，其中，VA RNA编码序列包含内部启动子的至少两个突变。55.权利要求52
‑
54中任一项所述的细胞，其中，VA RNA的表达是由U6启动子驱动的。56.权利要求52
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55中任一项所述的细胞，由VA RNA基因编码序列的上游组成，包含(从5
’
端到3
’
端)：a)U6启动子序列的第一部分；b)第一重组位点；c)填充片段序列；d)第二重组位点；和e)U6启动子序列的第二部分。57.权利要求56所述的细胞，其中，填充片段序列可被重组酶切除。58.权利要求56或57所述的细胞，其中，填充片段序列包含基因编码序列。59.权利要求56至58中任一项所述的细胞，其中，填充片段序列包含一个启动子。60.权利要求59所述的细胞，其中，启动子是一个组成型启动子。61.权利要求60所述的细胞，其中，启动子是CMV启动子。62.权利要求1
‑
61中任一项所述的细胞，其中，第一个多核苷酸构建体包含：a)Rep基因序列的第一部分；b)Rep基因序列的第二部分；c)Cap基因的序列；和d)位于Rep基因序列第一部分和第二部分之间的可切除元件。63.权利要求62所述的细胞，其中，可切除元件包含一个停止信号序列。64.权利要求62或63所述的细胞，其中，可切除元件包含兔β球蛋白内含子。65.权利要求62
‑
64中任一项所述的细胞，其中，可切除元件包含一个外显子。66.权利要求62
‑
64中任一项所述的细胞，其中，可切除元件包含一个内含子和一个外显子。67.权利要求62
‑
64中任一项所述的细胞，其中，可切除元件包含一个内含子。68.权利要求62
‑
67中任一项所述的细胞，其中，两个剪接位点被定位在Rep基因序列的第一部分的和Rep基因序列的第二部分之间。69.权利要求68所述的细胞，其中，两个剪接位点是一个5
’
端剪接位点和一个3
’
端剪接位点。70.权利要求69所述的细胞，其中，5
’
端剪接位点是兔β球蛋白5
’
端剪接位点。71.权利要求68或69所述的细胞，其中，3
’
端剪接位点是兔β球蛋白3
’
端剪接位点。72.权利要求62
‑
67中任一项所述的细胞，其中，三个剪接位点被定位在Rep基因序列的第一部分和第二部分之间。73.权利要求72所述的细胞，其中，三个剪接位点是5
’
端剪接位点、第一个3
’
端剪接位点和第二个3
’
端剪接位点。
74.权利要求73所述的细胞，其中，第一个3
’
端剪接位点是第二个3
’
端剪接位点的重复。75.权利要求72或73所述的细胞，其中，第一个3
’
端剪接位点是兔β球蛋白3
’
端剪接位点。76.权利要求72
‑
74中任一项所述的细胞，其中，第二个3
’
端剪接位点是兔β球蛋白3
’
端剪接位点。77.权利要求62
‑
74中任一项所述的细胞，其中，可切除元件包含一个重组位点。78.权利要求77所述的细胞，其中，重组位点是Lox位点或FRT位点。79.权利要求78所述的细胞，其中，Lox位点是loxP位点。80.权利要求62
‑
79中任一项所述的细胞，其中，可切除元件包含(从5
’
端到3
’
端)：a)5
’
端剪接位点；b)第一重组位点；c)第一个3
’
端剪接位点；d)停止信号序列；e)第二重组位点；以及f)第二个3
’
端剪接位点。81.权利要求62
‑
79中任一项所述的细胞，其中，可切除元件包含(从5
’
端到3
’
端)：a)5
’
端剪接位点；b)第一间隔区。c)第二间隔区，其包含：i)第一重组位点。ii)第一个3
’
端剪接位点。iii)停止信号序列；和iv)第二重组位点；和d)包含第二个3
’
端剪接位点的第三间隔区。82.权利要求81所述的细胞，其中，第一间隔区序列包含一个内含子。83.权利要求81或82所述的细胞，其中，第一间隔区包含与SEQ ID NO:1具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的序列。84.权利要求81至83中任一项所述的细胞，其中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：沙普治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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