抑制猪RAB32基因表达的制剂在制备猪抗猪伪狂犬病毒感染药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程及生物医药领域，公开了抑制猪RAB32基因表达的制剂在制备猪抗猪伪狂犬病毒感染药物中的应用，所述的RAB32基因的mRNA在猪中的NCBI登录号为NM_001123176.1。本发明专利技术发现该基因在PK15细胞中被敲除能够抑制PRV的增殖，故本基因可作为抑制PRV释放的疫苗药物的开发与抗病育种研究的新型靶点。苗药物的开发与抗病育种研究的新型靶点。

【技术实现步骤摘要】
抑制猪RAB32基因表达的制剂在制备猪抗猪伪狂犬病毒感染药物中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程及生物医药领域，具体涉及抑制猪的RAB32基因表达的制剂在制备猪抗猪伪狂犬病毒感染药物中的应用。

技术介绍

[0002]猪伪狂犬病(Pseudorabies，简称PR)是由猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，简称PRV)引起的猪的急性传染病。可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。自PR于1813年在美国首次被发现(Hanson et al.1954)，现已在世界多个国家和地区猪群中均频繁出现PR流行，自1948年我国首次发现猫被PRV感染后，多种动物均发现被PRV感染(陈焕春.2015)。我国在引进Bartha
‑
K61疫苗在一定程度上控制了PR的流行。但随着我国养猪业的发展，PR的发病率明显增长，流行特点也发生变化，流行范围逐渐扩大，经典毒株疫苗已无法提供完全保护且缺乏有效的抗病毒药物。随着科技发展，培育抗病新品种成为有效防治猪病的新途径，已有研究利用CRISPR/Cas9技术培育出抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的基因编辑猪(Randall et al.2017,Xu et al.2020)。由于PRV、病毒与宿主(猪)互作机理研究不完全以及缺乏可用于抗病育种的靶基因等问题，严重制约了靶向PRV的药物开发及抗病育种的进程。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供了抑制猪RAB32基因表达的制剂在制备猪抗猪伪狂犬病毒感染药物中的应用，所述的RAB32基因的mRNA在猪中的NCBI登录号为NM_001123176.1，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0005]抑制猪RAB32基因表达的制剂在制备抗PRV感染药物中的应用；所述的RAB32基因的mRNA在猪中的NCBI登录号为NM_001123176.1，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。
[0006]以上所述的应用中，所述的RAB32基因为SEQ ID NO.1所示。
[0007]以上所述的应用中，优选的，所述的抑制方法包括但不限于针对猪RAB32基因的CRISPR/Cas9敲除技术。
[0008]当使用CRISPR/Cas9敲除技术时，抑制猪中RAB32基因表达的制剂为gRNA：5'
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GTCGTCTTTGATATATCGAG
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3'。
[0009]本专利技术的保护内容还包括：一种抗PRV感染的细胞模型，其特征在于包含有靶向敲除猪RAB32基因的表达制剂。
[0010]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0011]申请人通过CRISPR/Cas9敲除技术在PK15细胞中靶向敲除RAB32的表达，首次发现敲除RAB32的表达的细胞可以通过抑制PRV的增殖从而抵抗PRV的感染，该基因可作为PRV的新型抗病靶点。本专利技术为研制有效安全防治PR的新型疫苗药物提供了新的靶标，也为抗PR
的育种研究提供了新候选靶基因，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0012]图1：靶向猪RAB32基因质粒的构建及验证；
[0013]其中：(A)设计靶向猪RAB32基因的gRNA；
[0014](B)构建靶向猪RAB32基因的质粒；
[0015](C)菌液PCR鉴定质粒构建成功；
[0016](D)测序鉴定质粒构建成功。
[0017]图2：PK15
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Cas9
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RAB32单克隆细胞系的构建及验证；
[0018](A)基因DNA测序PK15
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Cas9
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RAB32细胞中RAB32基因序列；
[0019](B)Western Blot检测PK15
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Cas9
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RAB32细胞中RAB32蛋白的表达；
[0020](C)MTT检测KO
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NC细胞和KO
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RAB32细胞的活性。
[0021]图3：流式分析和IFA检测PK15细胞敲除RAB32后对PRV感染的影响。
[0022](A)流式分析敲除RAB32后对PRV感染的影响；
[0023](B)统计A图中阳性细胞比例(*P＜0.05，**P＜0.01)；
[0024](C)IFA检测敲除RAB32后对PRV蛋白表达的影响。
[0025]图4：PK15细胞敲除RAB32后，对PRV粒子的释放的影响；
[0026]PK15细胞敲除RAB32后，PRV(MOI＝1)感染36h后TCID
50
检测细胞上清中PRV滴度(*P＜0.05)。
具体实施方式
[0027]本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0028]实施例1：
[0029]RAB32敲除细胞系的构建及验证
[0030]目的基因RAB32基因的mRNA的NCBI号为NM_001123176.1，对应的CDS序列为为SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.2所示蛋白。
[0031]1.1gRNA设计及表达载体的构建
[0032](1)gRNA的设计：选择需要gRNA靶向基因位置的部分序列，设计敲除gRNA的序列见图1中A；gRNA：5'
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GTCGTCTTTGATATATCGAG
‑
3'。
[0033](2)将公司合成的oligo gRNA稀释为100nM后，互补序列各取5μL混合。
[0034](3)将混合液上PCR仪器，退火得到双链gRNA。程序如下：95℃，10min，65℃，40min，10℃，10min。
[0035](4)将lenti
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sgRNA puro(Addgene，104990)载体使用BbsI或BsmbI酶切回收后，使用T4连接酶将gRNA与载体连接。
[0036](5)转化载体到DH5α，涂平板，挑单克隆菌落送往测序验证。
[0037](6)阳性菌落PCR和测序鉴定正确后，扩繁菌液按TIANGEN公司的质粒小提试剂盒(DP103)的操作说明书操作提取质粒。
[0038]结果如图1所示，靶向RAB32基因的gRNA成功连接到质粒中，说明gRNA表达载体构
建成功。
[0039]1.2构建RAB32敲除单克隆细胞系
[0040](1)按jetPRIME公司的DNA转染试剂(114
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15)的操作说明书，利用辅助质粒psPax2(Addgene，12260)、pMD2.G(Addgene，12259)进行慢病毒gRNA包装。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 抑制猪RAB32基因表达的制剂在制备猪抗PRV感染药物中的应用，所述的RAB32基因的mRNA在猪中的NCBI登录号为NM_001123176.1，或是编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。2. 根据权利要求1所述的应用，所述的RAB32基因的CDS为SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述应用，所述抑制猪RAB32基因表达的方法是针对猪RAB32基因的CRISPR/Cas9敲除技术。4.根据权利要求3所述的应用，敲除猪中NCBI登录号为NM_0011...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文涛，孙玉梅，刘忠柱，张淑君，上官爱哨，张梦佳，郭光浩，何兴林，曹华，何启盖，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：