一种基于水体中痕量迟缓爱德华氏菌检测的防止黄颡鱼患病的方法技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种基于水体中痕量迟缓爱德华氏菌检测的防止黄颡鱼患病的方法，本发明专利技术是一种超高灵敏度的从水体中检测迟缓爱德华氏菌的方法，该方法的灵敏度可达到1

【技术实现步骤摘要】
一种基于水体中痕量迟缓爱德华氏菌检测的防止黄颡鱼患病的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于水体中痕量迟缓爱德华氏菌检测的防止黄颡鱼患病的方法。

技术介绍

[0002]黄颡鱼多栖息于缓流多水草的湖周浅水区和入湖河流处，营底栖生活，尤其喜欢生活在静水或缓流的浅滩处，且腐殖质多和游泥多的地方。杂食性，自然条件下以动物性饲料为主，鱼苗阶段以浮游动物为食，成鱼则以昆虫及其幼虫、小鱼虾、螺蚌等为食，也吞食植物碎屑。分布于老挝、越南、中国、朝鲜、俄罗斯西伯利亚东南部。黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是一种名贵的淡水经济鱼类，俗称黄腊丁、黄鼓鱼、黄鸭叫等，其肉质细嫩，无肌间刺，多脂肪，其中蛋白质含量为15.37％，脂肪为16.1％，17种氨基酸总量达14.79％，具很高的营养价值，同时因其肉性味甘、平，有祛风、利尿之功效，可用以主治水肿、喉痹肿痛等症，有一
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定的药用价值，深受消费者青睐。由于自河流湖泊中捕捞的产量难以满足市场需求，黄颡鱼的人工养殖几年前在全因各地悄然兴起。近年来由于养殖规模的扩大和养殖密度的提高，黄颡鱼出现了各种疾病，如病毒病、细菌病和寄生虫病，导致严重的经济损失。
[0003]水产养殖中，由细菌引起的疾病是通过水体传播病原的。在鱼体大量感染病原之前，细菌一定先在水体中进行增殖，增值到一定的浓度才能够大面积传播病原细菌。
[0004]迟钝爱德华氏菌，属肠杆菌科(Enterobactefi.aceae)爱德华氏菌属(Edwardsiella)。迟钝爱德华氏菌是目前在水产养殖中有极大危害的病原菌。自Hoshina(1962)首次报道引发日本鳗鲡红病(reddisease)以来，到月前，迟钝爱德华氏菌已经在二十多种鱼类中引起了病害，包括淡水鱼类和海水鱼类。实际上，该菌的宿主范围十分广泛，从鱼类、两栖类、爬行类直到哺乳类包括人类在内都有该菌感染的病例报道。
[0005]目前，现有黄颡鱼迟钝爱德华氏菌防治技术都是要等到鱼体发病后才开始治疗，到发病这个阶段，病原在水体和鱼体中已经大量存在，非常难以根治，一般都需要长期用药才能控制，会造成鱼体抗生素残留以及水体药物残留等问题，却还没有人研究如何针对养殖黄颡鱼时能快速消灭病原的研究与报道。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于专利技术一种超高灵敏度的，从水体中检测迟缓爱德华氏菌的方法，该方法的灵敏度可达到1
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10CFU/10ml。通过此方法，我们可以在迟缓爱德华氏菌大面积感染黄颡鱼之前，就从水体中检出迟缓爱德华氏菌是否存在。如果存在，立刻采取池塘消毒，投喂抗生素等措施对疾病进行预防。由于治疗手段是在疾病发展的最初期实施，因此治疗效果非常明显。
[0007]为达到上述目的，提供一种基于水体中痕量迟缓爱德华氏菌检测的防止黄颡鱼患病的方法，包括以下步骤：
[0008](1)、取1000ml池塘水，平均装入4个250ml离心管中离心；
[0009](2)、去掉上清液，每管留8
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12ml的液体，与沉淀重悬均匀，将4管重悬液装入50ml离心管中离心，去掉上清，留1
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2ml的液体，与沉淀重悬均匀得到重悬液；
[0010](3)、提取重悬液的总DNA，并以所提取总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增迟缓爱德华氏菌gyrB(促旋酶B亚单位基因)基因片段；扩增片段大小为1150bp；
[0011](4)、将上一步反应液稀释100倍，以稀释液为模板，采用染料法进行实时荧光PCR，扩增片段大小为420bp；反应过程中实时观察荧光信号，根据荧光信号判断水体中是否存在迟缓爱德华氏菌；
[0012](5)、若出现荧光扩增峰判定水体中不存在迟缓爱德华氏菌；若不出现荧光扩增峰判定水体中存在迟缓爱德华氏菌；对检测结果为阳性的池塘进行针对性治疗，处理步骤如下：
[0013](51)第1天：使用二氧化氯进行消毒；使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6
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8％的二氧化氯泡腾片300g；
[0014](52)第2天
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第3天：投喂抗菌药物；投喂标准每10000斤鱼投喂恩诺沙星25g(按药物有效含量计)，药物溶于水后拌料投喂；每天投喂一次，连续2天；
[0015](53)第4天：使用二氧化氯进行消毒；使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6
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8％的二氧化氯泡腾片300g。
[0016]进一步说明，在步骤(3)中，所述扩增所用引物序列为P1：5
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AAGGCTACACCAAGAAGAAC
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3，P2：5
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TGAACAAAGTCGAAATCGAA
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3。
[0017]进一步说明，在步骤(3)中，所述扩增反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸70s，30个循环。
[0018]进一步说明，在步骤(4)中，所述荧光PCR所用引物序列为P3:5
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CATTCGTACCCTGTTGTTGA
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3，P4：5
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CTGCCATGCTGCTCTTTCTC
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3。
[0019]进一步说明，在步骤(4)中，所述扩增反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，40个循环。
[0020]进一步说明，步骤(1)和步骤(2)所述的离心，是8000rpm离心10min。
[0021]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0022]本专利技术一种超高灵敏度的，从水体中检测迟缓爱德华氏菌的方法，该方法的灵敏度可达到1
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10CFU/10ml。通过此方法，我们可以在迟缓爱德华氏菌大面积感染黄颡鱼之前，就从水体中检出迟缓爱德华氏菌是否存在。如果存在，立刻采取池塘消毒，投喂抗生素等措施对疾病进行预防。由于处理手段是在疾病发展的最初期实施，因此防止效果非常明显。
【附图说明】
[0023]图1：本专利技术实施例1的PCR反应特异性实验的图；
[0024]以P1/P2为引物，1:DNA分子质量标准；2.迟缓爱德华氏菌；3.阴性对照；4.嗜水气单胞菌；5.摩氏摩根菌；6.维氏气单胞菌；7.路德维希肠杆菌；8.志贺邻单胞菌；9.苏云金芽孢杆菌；10.简达气单胞菌；11.金黄色葡萄球菌。
[0025]图2：本专利技术实施例1的巢氏PCR灵敏度试验的图；
[0026]其中，1
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8模板浓度分别为7.2
×
104CFU/10ml，7.2
×
103CFU/10ml，7.2
×
102CFU/
10ml，7.2CFU/10ml，0.72CFU/10ml，0.072CFU/1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于水体中痕量迟缓爱德华氏菌检测的防止黄颡鱼患病的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、取1000ml池塘水，平均装入4个250ml离心管离心；(2)、去掉上清液，每管留8
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12ml的液体，与沉淀重悬均匀，将4管重悬液装入50ml离心管中离心，去掉上清，留1
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2ml的液体，与沉淀重悬均匀得到重悬液；(3)、提取重悬液的总DNA，并以所提取总DNA为模板，进行PCR扩增，扩增迟缓爱德华氏菌gyrB基因片段；扩增片段大小为1150bp；(4)、将上一步反应液稀释100倍，以稀释液为模板，采用染料法进行实时荧光PCR，扩增片段大小为420bp；反应过程中实时观察荧光信号，根据荧光信号判断水体中是否存在迟缓爱德华氏菌；(5)、若出现荧光扩增峰判定水体中不存在迟缓爱德华氏菌；若不出现荧光扩增峰判定水体中存在迟缓爱德华氏菌；对检测结果为阳性的池塘进行针对性治疗，处理步骤如下：(51)第1天：使用二氧化氯进行消毒；使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6
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8％的二氧化氯泡腾片300g；(52)第2天
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第3天：投喂抗菌药物；投喂标准每10000斤鱼投喂恩诺沙星25g(按药物有效含量计)，药物溶于水后拌料投喂；每天投喂一次，连续2天；(53)第4天：使用二氧化氯进行消毒；使用量为：1亩水体(按1米水深计)使用有效含量6
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8％的二氧化氯泡腾片30...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄杰，易弋，王志强，赵早亚，周玥琪，何欢，文衍红，罗福广，
申请(专利权)人：柳州市渔业技术推广站，
类型：发明
国别省市：