提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法技术

本发明专利技术提供了一种提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法，属于生物技术领域。本发明专利技术采用PCR结合酶切法对土壤中的细菌16S rRNA基因进行片段化，根据不同的16S rRNA基因片段图谱分布信息，初步筛选得到测序的细菌菌株，显著减少了细菌分离鉴定过程中测序的数量，可有效避免重复测序、漏测等现象，同时将不同种类细菌检出的比例由常规方法的41.09％提高到PCR

【技术实现步骤摘要】
提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及到一种提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法。

技术介绍

[0002]土壤生态系统孕育着丰富的微生物资源，每克土壤中约含有109个微生物。土壤微生物具有丰度高、种类复杂、难于培养等特点，对于土壤样品微生物的分离培养多采用稀释涂布的方法，目前只有不到1％的土壤微生物被分离出来，严重制约了对其生态功能的认知及高值化利用的进程。随着分子生物学的发展，细菌的分类学鉴定已由形态观察转变为结合分子生物学的多相分类学方法。由于细菌的16S rRNA基因具有较强的保守性，16S rRNA基因测序是鉴定细菌的分类学地位的金标准。但是在初始挑菌过程中由于细菌菌落较小，很难从形态上区分不同种类的细菌，造成重复测序、漏测等现象。因此，如何有效提高不同种类细菌的检出率对于本领域而言将是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法，该方法可显著减少细菌菌株测序的数量，可有效避免重复测序、漏测等现象，大大提高了不同种类细菌的检出率。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术提供了一种提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法，采用PCR结合酶切法对土壤中待分离鉴定的细菌的16S rRNA基因进行片段化，根据限制性酶切片段多态性的原理对PCR产物进行初步筛选，先去除基因片段分布相同的扩增产物，然后对基因片段分布不同的扩增产物进行测序鉴定，得到不同种类细菌的分类学地位。
[0005]作为优选，酶切法所采用的酶为限制性内切酶BsuR I。
[0006]作为优选，所述分离方法包括以下步骤：
[0007]对土壤中的细菌进行分离培养，得到细菌的纯培养物；
[0008]提取所得细菌的纯培养物的菌株基因组DNA，以其为模板，对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0009]使用限制性内切酶BsuR I对PCR扩增产物进行酶切，得到长度多态性的基因片段图谱；
[0010]基于长度多态性的基因片段图谱，对具有相同和不同的基因片段分布的扩增产物进行区分，并对具有不同基因片段分布的扩增产物进行测序鉴定，得到不同种类细菌的分类学地位。
[0011]作为优选，对具有不同基因片段分布的扩增产物进行测序，并将测序所得的序列数据与已知基因序列进行同源性比对，获得不同种类细菌的分类学地位。
[0012]作为优选，对具有相同基因片段分布的扩增产物，结合菌株的形态特征进行判断，若菌落形态相似，则初步认定为同种细菌。
[0013]作为优选，PCR扩增反应体系为：
[0014]10
×
buffer为3μL、dNTP为3μL、正向引物为0.3μL、反向引物为0.3μL、taq为0.15μL、DNA template为1μL、dd H2O为22.25μL，共计30μL；
[0015]PCR扩增程序为：预变性94℃，5min；94℃，1min，55℃1min，72℃1.5min，循环30次；延伸72℃10min。
[0016]作为优选，正向引物为27F：5
’‑
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
‑3’
[0017]反向引物为1492R：5
’‑
GGTTACCTTGTTACGACTT
‑3’
。
[0018]作为优选，酶切反应体系为：
[0019]10
×
Fast buffer为0.4μL、扩增产物为2.0μL、三蒸水为3.4μL、BsuR I酶为0.2μL，共计6.0μL；
[0020]酶切反应条件为37℃恒温水浴，10min。
[0021]作为优选，得到的不同种类细菌的比例通过以下公式计算得到：
[0022]不同种类细菌比例＝(不同种细菌数量)/测序数量
×
100％，
[0023]其中，测序数量对应基因片段分布不同的扩增产物的数量，不同种细菌数量对应经序列比对后，获得的不同种类细菌的数量。
[0024]本专利技术还提供了一种限制性内切酶BsuR I在提高土壤样品中不同种类细菌分离方法中的应用。
[0025]作为优选，限制性内切酶BsuR I通过特异性识别细菌的16S rRNA基因上含有的“GGCC”序列，以将基因组DNA酶切成不同的片段。
[0026]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
[0027]本专利技术采用PCR结合酶切法对土壤中的细菌16S rRNA基因进行片段化，根据不同的16S rRNA基因片段图谱分布信息，初步筛选得到测序的细菌菌株，显著减少了细菌分离鉴定过程中测序的数量，可有效避免重复测序、漏测等现象，同时将不同种类细菌检出的比例由常规方法的41.09％提高到PCR
‑
酶切法的84.13％，显著提高了不同种类细菌的检出率。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例提供的部分菌株16S rRNA基因使用限制性内切酶BsuR I酶切后的片段多态性，其中，M：marker，泳道3、13、23为阴性对照，其他泳道为21株菌PCR酶切后的产物；
[0029]图2为本专利技术实施例提供的玉溪烟草根际细菌在属水平的分布特征示意图。
具体实施方式
[0030]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]实施例1内切酶的选择
[0032]从Greengenes上下载16S rDNA序列共计108,456条，对其进行酶切位点的检索。选
用3种可识别4个碱基的内切酶：BsuR I(GGCC)、Rsa I(GTAC)和Taq I(TCGA)。三种内切酶的酶切位点数见表1。
[0033]表1三种内切酶的酶切位点数
[0034][0035]如表1所示，在Greengenes gg_13_5数据库中，检索到的BsuR I酶切位点最多，高达818,017个，平均每条序列7.54个酶切位点，远高于Rsa I和Taq I内切酶。酶切位点多可以提高不同序列的检出比例，因此，本实验选用BsuR I内切酶用于后续实验。
[0036]实施例2
[0037]2.1材料
[0038]实验样品：来自云南玉溪烟草根际土壤样品
[0039]实验数据：从greengenes网站(https://greengenes.lbl.gov/Download/)下载16S rDNA全长序列，版本gg_13_5。
[0040]2.2方法
[0041]2.2.1菌株的分离培养
[0042]称取0.3g土壤样品，置于装有30mL生理盐水(0.85％，NaCl)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.提高土壤样品中不同种类细菌的分离方法，其特征在于，采用PCR结合酶切法对土壤中待分离鉴定的细菌的16S rRNA基因进行片段化，根据限制性酶切片段多态性的原理对PCR产物进行初步筛选，先去除基因片段分布相同的扩增产物，然后对基因片段分布不同的扩增产物进行测序鉴定，得到不同种类细菌的分类学地位。2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，酶切法所采用的酶为限制性内切酶BsuRI。3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：对土壤中的细菌进行分离培养，得到细菌的纯培养物；提取所得细菌的纯培养物的菌株基因组DNA，以其为模板，对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；使用限制性内切酶BsuR I对PCR扩增产物进行酶切，得到长度多态性的基因片段图谱；基于长度多态性的基因片段图谱，对具有相同和不同的基因片段分布的扩增产物进行区分，并对具有不同基因片段分布的扩增产物进行测序鉴定，得到不同种类细菌的分类学地位。4.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，对具有不同基因片段分布的扩增产物进行测序，并将测序所得的序列数据与已知基因序列进行同源性比对，获得不同种类细菌的分类学地位；对具有相同基因片段分布的扩增产物，结合菌株的形态特征进行判断，若菌落形态相似，则初步认定为同种细菌。5.根据权利要求3或4所述的分离方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：10
×
buffer为3μL、dNTP为3μL、正向引物为0.3μL、反向引物为0.3μL、taq为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓强，梁金昌，王瑞，宋学茹，袁源，陈勇华，艾永峰，宋广龙，韦承建，
申请(专利权)人：湖北省烟草公司恩施州公司云南省烟草公司玉溪市公司贵州省烟草公司铜仁市公司，
类型：发明
国别省市：