一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物、试剂盒和应用，该引物探针组合物包括检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物、试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于非发酵革兰阴性杆菌的鉴定
，具体涉及一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物、试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]在非发酵革兰阴性杆菌中，鲍曼不动杆菌所导致的血流感染率高居不下，以碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(Carbapenem
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resistant Acinetobacter Baumanni，CRAB)为主，其诊断不及时，导致临床治疗难度大、患者病死率高，已然成为了现今医疗卫生行业的一大挑战。
[0003]CRAB的耐药机制十分复杂，其中产OXA类碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因之一。鲍曼不动杆菌的检测方法主要有血培养法、PCR或qPCR法。现有方法主要技术问题有：
[0004]1、灵敏度低：低浓度模板检测时结果无法确定(如采集样本前使用抗生素、样本中细菌浓度低以及血液中某些杀菌物质)，存在漏检低浓度样本的可能；2、培养法耗时较长，通常需要培养18h以上，当天无法出具结果，可能会延误治疗。
[0005]而目前并没有美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐或专家共识认可的鲍曼不动杆菌适用的碳青霉烯酶分型实验，故建立针对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的快速鉴定方法，对于弥补鲍曼不动杆菌适用的产酶分型实验匮乏，以及缩短常规报告时长，从而帮助临床为血流感染CRAB患者尽早、及时选择抗菌药物、制定合理的治疗和用药方案，具有十分重要的临床意义与价值。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，灵敏度高，特异性强，可实现检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因OXA
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23的特异性扩增检测，适用于感染CRAB的筛查和诊断；本专利技术的目的之二在于提供一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物在制备筛查碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染的产品中的应用；本专利技术的目的之三在于提供一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的试剂盒，其准确度高、便捷性好，将微滴化与PCR扩增技术结合，适用于感染的早期筛查、辅助诊断和预后评估。
[0007]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0008]一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的引物对和探针；
[0009]检测鲍曼不动杆菌gltA基因的引物对的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；鲍曼不动杆菌gltA基因的探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；
[0010]检测鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的引物对的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列；鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。
[0011]进一步，所述引物探针组合物还包括用于检测内参基因的内参引物对和对应的内参探针；所述内参探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，且所述内参探针的荧光基团与分别用于检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的探针的荧光基团均不相同。
[0012]进一步，所述内参基因为人GAPDH基因；人GAPDH基因的内参引物对的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列；人GAPDH基因的内参探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。
[0013]进一步，用于检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的探针的5
’
端标记有FAM、ROX、VIC和CY5荧光基团中的任一种；探针的3
’
端标记有MGB、BHQ和TAMRA淬灭基团的任一种。
[0014]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0015]一种上述的用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物在制备筛查碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染的产品中的应用。
[0016]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0017]一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的试剂盒，包括上述的鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物。
[0018]进一步，还包括核酸提取试剂和PCR反应试剂中的至少一种。
[0019]进一步，该试剂盒的检测方法包括以下步骤：
[0020]提取待测样本中菌体的基因组，以提取的基因组作为DNA模板，再加入上述的鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，得到检测液，对检测液进行微滴化处理后，再进行微滴式数字PCR扩增，检测荧光信号并判定结果。
[0021]具体地，所述微滴式数字PCR扩增的程序为：
[0022]1)在90～96℃下反应4～6min，循环1～2次；
[0023]2)在90～95℃下反应15～25s，然后在50～70℃下循环0.5～2min，循环40～50次；
[0024]3)在30～40℃下保持到反应结束。
[0025]进一步，所述检测液包括以下成分：上述的鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物、2
×
ddPCR Mix、DNA聚合酶、DNA模板和水。
[0026]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0027](1)本专利技术的鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物是选取gltA基因、OXA
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23基因进行鲍曼不动杆菌及其耐药性的检测，人GAPDH基因作为模拟临床血流感染样本的内参基因；通过序列比对，对相应基因特异性区段进行引物探针设计，所以该引物探针组合物对碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌具有较高的灵敏度和特异性。
[0028](2)本专利技术的试剂盒包括上述的引物探针组合物，该试剂盒能直接从血流感染CRAB患者全血标本中直接快速检测鲍曼不动杆菌及其耐药基因OXA
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23，以弥补鲍曼不动杆菌适用的产酶分型实验的匮乏的问题，并缩短常规报告时长，为临床更早确定合理治疗方案提供方法。具体地，该试剂盒采用微滴式数字PCR的检测方法，通过将一个待分析的PCR反
应体系进行微滴化处理，生成的每个微滴中将含有一个、多个或不含有待检测的核酸靶分子，数万个微滴进行独立PCR扩增反应后，收集每个微滴的荧光信号并进行统计学分析，从而实现对病原体DNA或RNA的绝对定量，基于数字PCR的优势，以更好的敏感性，在较低水平拷贝数的样本中也能实现直接对全血样本中存在碳青霉烯类鲍曼不动杆菌定性的目的，缩短了检验所需时间，可以更早地提示临床本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的引物对和探针；检测鲍曼不动杆菌gltA基因的引物对的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列；鲍曼不动杆菌gltA基因的探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；检测鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的引物对的核苷酸序列包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列；鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6所示的序列。2.如权利要求1所述的用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物还包括用于检测内参基因的内参引物对和对应的内参探针；所述内参探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团，且所述内参探针的荧光基团与分别用于检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的探针的荧光基团均不相同。3.如权利要求2所述的用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，其特征在于，所述内参基因为人GAPDH基因；人GAPDH基因的内参引物对的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的序列；人GAPDH基因的内参探针的核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列。4.如权利要求1所述的用于鉴定碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌的引物探针组合物，其特征在于，用于检测鲍曼不动杆菌gltA基因、鲍曼不动杆菌OXA
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23耐药基因的探针的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱德途，田金金，秦明明，蔡凯贤，
申请(专利权)人：广州利德曼医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：