一种快速芯片式的支原体检测方法技术

本申请提出了一种快速芯片式的支原体检测方法，包括以下步骤：(1)提取反应样品；(2)配置qPCR反应体系，qPCR反应体系包括反应样品、引物探针混合液、基因扩增液以及内部对照IC；(2)将配置完成的qPCR反应体系添加至芯片式反应容器内；(4)芯片式反应容器插入PCR仪器内，进行扩增反应；反应条件为：50℃变性60秒，95℃变性30秒，95℃15秒，60℃25秒，45个循环；反应结束后，得到两组CT值；(5)两组CT值与IC值和PC值进行比较，判断支原体的阴阳性。本发明专利技术支原体高保真DNA扩增反应体系涉及支原体报告基因的引物探针设计、阳性/内部对照品的设计、扩增反应缓冲液，可以保证高效、快速、稳定的获得支原体的检测结果。原体的检测结果。原体的检测结果。

【技术实现步骤摘要】
一种快速芯片式的支原体检测方法


[0001]本申请涉及生物学分子核酸检测的
，尤其是涉及一种快速芯片式的支原体检测方法。

技术介绍

[0002]支原体(Mycoplasma)是一类没有细胞壁的原核细胞型微生物，多形性且可通过0.45μm除菌过滤器，是目前已知能在无生命培养基中生长繁殖的最小微生物。
[0003]自然界常见的20种支原体中，10种与实验室支原体污染密切相关，即精氨酸支原体(Mycoplasmaarginini)、口腔支原体(Mycoplasmaorale)、鸡败血支原体(Mycoplasamgallisepticum)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、关节液支原体(Mycoplasmasynoviae)、发酵支原体(Mycoplasmafermentans)、猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)、莱氏支原体(Acholeplasmalaidlawii)、螺原体(Spiroplasmacitri)、唾液支原体(Mycoplasmasalivarium)。作为细胞培养过程中常见的外源性污染物。
[0004]支原体污染的检测方法较多，但由于临床治疗用细胞制剂终产品不能进行灭菌处理，且目前的支原体检测方法培养法和指示细胞培养法(DNA染色法)所需时间较长，在活细胞制剂终产品的快速放行检测中有一定的局限性，因而需要更完善的细胞制剂终产品的支原体检测方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提出了一种快速芯片式的支原体检测方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0007]一种快速芯片式的支原体检测方法，包括以下步骤：
[0008](1)提取反应样品；
[0009](2)配置qPCR反应体系，qPCR反应体系包括反应样品、引物探针混合液、基因扩增液以及内部对照IC；
[0010](3)将配置完成的qPCR反应体系添加至芯片式反应容器内；
[0011](4)芯片式反应容器插入PCR仪器内，进行扩增反应；反应条件为：50℃变性60秒，95℃变性30秒，95℃15秒，60℃25秒，45个循环；反应结束后，得到两组CT值；
[0012](5)两组CT值与IC值和PC值进行比较，判断支原体的阴阳性。
[0013]本专利技术进一步技术方案设置为，所述引物探针包括PC引物探针和IC引物探针；
[0014]所述PC引物探针为：
[0015]MF1：5
’‑
GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT
‑3’
；
[0016]MR1：5
’‑
TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC
‑3’
；
[0017]MP2：5
’‑
FAM
‑
TAGTCCACGCCGTAAACGATGATC
‑
TAMRA
‑3’
；
[0018]所述IC引物探针为：
[0019]MF22：5
’‑
CAGGTACGGCTGTCATCACTTAGA
‑3’
；
[0020]MR22：5
’‑
CATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTA
‑3’
；
[0021]MP22：5
’‑
Cy5
‑
GCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG
‑
BHQ2
‑3’
。
[0022]本专利技术进一步技术方案设置为，所述阳性对照为PC序列克隆到VectorPuc57：
[0023]GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATCATTAGTCGGTGGGAGCCACTGACGCAGCTAACGCATTAAATGATCCGCCTGAGTAGTATGCTCGCAAGAGTGAAACTTAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTTGAAGATACGCGGAGAACCTTACCCACTCTTGACATCCTTTGCAAAGCTATAGAGATATAGTGGAGGTTAACAGAGTGACAGATGGTGCA。
[0024]本专利技术进一步技术方案设置为，所述内部对照为IC序列克隆到VectorPuc57：
[0025]GAGCCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCACTTAGACCTCACCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGAGGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCTTACACTTGCTTCTGACGCAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTACACCTGACTCCTGAGG。
[0026]本专利技术进一步技术方案设置为，所述qPCR反应体系共计15μL，包括：
[0027]反应样品：3.0
‑
4.0μL；
[0028]引物探针混合液；1.5
‑
2.5μL；
[0029]基因扩增液；7.5
‑
9.0μL；
[0030]内部对照IC；0.5
‑
1.0μL。
[0031]本专利技术进一步技术方案设置为，所述qPCR反应体系包括：
[0032]反应样品；3.0μL；
[0033]引物探针混合液；1.5μL；
[0034]基因扩增液；9.9μL；
[0035]内部对照IC；0.6μL。
[0036]本专利技术进一步技术方案设置为，空白对照采用无核酶水。
[0037]本专利技术进一步技术方案设置为，阳性对照PC为支原体的特征序列。
[0038]与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
[0039]本专利技术支原体高保真DNA扩增反应体系涉及支原体报告基因的引物探针设计、阳性/内部对照品的设计、扩增反应缓冲液，可以保证高效、快速、稳定的获得支原体的检测结果。
[0040]本专利技术检测原理采用双通道荧光TaqManqPCR探针法检测支原体DNA，可定性检测细胞及细胞培养的上清液。FAM和CY5通道的CT值是否大于40判断结果的阴阳性。
附图说明
[0041]图1为本申请中快速PCR仪的结构示意图；
[0042]图2为本申请中快速PCR扩增芯片的结构示意图
[0043]图3为本申请qPCR扩增曲线图；
[0044]图4为本申请qPCR扩增图；
[0045]图5为本申请CHO的扩增图；
[0046]图6为本申请HEK293的扩增图；
[0047]图7为本申请E.co本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取反应样品；(2)配置qPCR反应体系，qPCR反应体系包括反应样品、引物探针混合液、基因扩增液以及内部对照IC；(3)将配置完成的qPCR反应体系添加至芯片式反应容器内；(4)芯片式反应容器插入PCR仪器内，进行扩增反应；反应条件为：50℃变性60秒，95℃变性30秒，95℃15秒，60℃25秒，45个循环；反应结束后，得到两组CT值；(5)两组CT值与IC值和PC值进行比较，判断支原体的阴阳性。2.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述引物探针包括PC引物探针和IC引物探针；所述PC引物探针为：MF1：5
’‑
GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT
‑3’
；MR1：5
’‑
TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC
‑3’
；MP2：5
’‑
FAM
‑
TAGTCCACGCCGTAAACGATGATC
‑
TAMRA
‑3’
；所述IC引物探针为：MF22：5
’‑
CAGGTACGGCTGTCATCACTTAGA
‑3’
；MR22：5
’‑
CATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTA
‑3’
；MP22：5
’‑
Cy5
‑
GCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG
‑
BHQ2
‑3’
。3.根据权利要求1所述的一种快速芯片式的支原体检测方法，其特征在于，所述阳性对照为PC序列克隆到VectorPuc57：GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄懿，姚杰，谢力琦，韩亚平，顾城玮，徐丹丹，吴赛男，
申请(专利权)人：北京吉检医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：