本发明专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及结直肠癌诱因病原体的检测，更具体地，涉及粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌的检测。本发明专利技术提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌的检测和区分。本发明专利技术的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。检测更为准确。检测更为准确。
【技术实现步骤摘要】
结直肠癌诱因病原体检测的组合物、试剂盒及其用途
[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及结直肠癌诱因病原体的检测，更具体地，涉及粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌的检测。
技术介绍
[0002]结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的发生与发展是由遗传因素、外部环境因素(如饮食结构、吸烟、饮酒等)、内部环境因素(如肠道微生物紊乱、免疫紊乱等)共同影响的过程。据统计数据表明，全球结直肠癌的发病率位居第3位，死亡率位居第4位，严重威胁人类健康。人体肠道微生态系统极其复杂，至少有100万亿种微生物定居于肠道内，在维持肠道的能量代谢、上皮细胞增殖及凋亡以及对病原微生物的防护等多种生理功能中起着至关重要的作用。但肠道菌群平衡一旦失衡，可引起多种肠道疾病，如炎症性肠病、肿瘤等。随着分子生物学及宏基因组学的深入研究，发现越来越多既往被忽视的微生物在结直肠癌的发生发展过程中起着重要的作用。
[0003]粪肠球菌(E.Faecalis)为革兰氏阳性厌氧菌，能够产生诱导DNA损伤和基因组不稳定的活性氧，诱导黏膜巨噬细胞产生可扩散的致染色体断裂剂，介导DNA损伤，其代谢物硫化氢和超氧化物自由基阴离子对结直肠黏膜有潜在的危害。
[0004]大肠杆菌(E.coli)是一种人类肠道共生菌，属于革兰氏阴性厌氧菌。大肠杆菌能够在结肠黏膜上定植，它可以通过多种方式增加黏膜通透性，从而诱发结直肠癌的发生。
[0005]具核梭杆菌(F.nucleatum)是一种革兰氏阴性厌氧菌。具核梭杆菌是口腔菌群的一员，常见于牙周病，在正常人肠道中很少发现。然而，具核梭杆菌在结肠腺瘤和结直肠癌中的水平升高，高水平的具核梭杆菌与结直肠癌的淋巴结转移相关。具核梭杆菌可以通过减少CD4+T细胞数量和下调TOX蛋白表达，抑制抗肿瘤免疫反应，从而推动结直肠癌的发生。
[0006]可见，粪肠球菌、大肠杆菌和具核梭杆菌都能够通过特定的方式参与结直肠癌的发展，由于上述三种病原体诱发结直肠癌的方式、病原体耐药性不同，因此需要针对具体的病原体制定有效的结直肠癌治疗策略。
[0007]因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且灵敏度高，特异性好。
技术实现思路
[0008]有鉴于此，第一方面，本专利技术提供一种结直肠癌诱因病原体联检并区分的组合物，包括：
[0009]如SEQ ID NO:1～3所示的检测粪肠球菌的上游引物、探针及下游引物；
[0010]如SEQ ID NO:4～6所示的检测大肠杆菌的上游引物、探针及下游引物；以及
[0011]如SEQ ID NO:7～9所示的检测具核梭杆菌的上游引物、探针及下游引物。
[0012]本专利技术提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实粪肠球菌、大肠杆菌、
具核梭杆菌的检测和区分。本专利技术的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
[0013]进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、探针及下游引物。
[0014]在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是人管家基因。
[0015]在一些具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、探针及下游引物。
[0016]进一步地，本专利技术组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
[0017]在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO 425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
[0018]在一些具体的实施方案中，粪肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；探具核梭杆菌针的荧光报告基团为ROX；大肠杆菌探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)；内标探针的荧光报告基团为CY5。
[0019]进一步地，在一些实施方案中，本专利技术的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本专利技术中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
[0020]本专利技术的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本专利技术中。
[0021]举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
[0022]在一些具体的实施方案中，本专利技术组合物用于荧光PCR。
[0023]进一步地，探针的3
’
末端还具有非荧光淬灭剂。
[0024]进一步地，探针的3
’
末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
[0025]在一个具体的实施方案中，探针的3
’
末端为BHQ1。
[0026]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
[0027]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各成分存在于同一个包装中。
[0028]进一步地，本专利技术的组合物的各成分以混合的形式存在。
[0029]第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备结直肠癌诱因病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌。
[0030]第三方面，本专利技术提供了一种结直肠癌诱因病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本专利技术的组合物。
[0031]进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
[0032]在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌的片段质粒或片段DNA中的至少一种。
[0033]进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0034]更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中
的至少一种。
[0035]更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、尿嘧啶糖基化酶(UDG)、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0036]进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
[0037]在一个具体的实施方案中，本专利技术试剂盒包括Taq酶、Mg
2+
、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。
[0038]常见的PCR缓冲液由Tris
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HCl、M本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌诱因病原体联检并区分的组合物，包括：如SEQ ID NO:1～3所示的检测粪肠球菌的上游引物、探针及下游引物；如SEQ ID NO:4～6所示的检测大肠杆菌的上游引物、探针及下游引物；以及如SEQ ID NO:7～9所示的检测具核梭杆菌的上游引物、探针及下游引物。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、探针及下游引物。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、探针及下游引物。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，粪肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；探具核梭杆菌针的荧光报告基团为ROX；大肠杆菌探针的荧光报告基团为HEX；内标探针的荧光报告基团为CY5。5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：王维，刘传，任小梅，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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