一种用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌的引物组合物及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌的引物组合物及应用，属于生物技术领域。能鉴别牛奶中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、芽孢杆菌、白色念珠菌。每种细菌的引物包括：外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，部分细菌的引物包含：环引物LF和LB。本发明专利技术可用于鉴别诊断区分引起奶牛乳房炎的病原菌。本发明专利技术提供的引物组合物检测引起奶牛乳房炎病原菌具有灵敏度好、特异性高、用时短、稳定性高等特点。性高等特点。性高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌的引物组合物及应用


[0001]本专利技术属于病原菌检测
，具体涉及一种用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌的引物组合物及应用。

技术介绍

[0002]奶牛乳房炎是危害奶牛生产的重要临床疾病之一，是世界奶牛业的主要危害因素之一，据报道我国奶牛乳房炎的发病率为41％
‑
60％，不仅引起产奶量的减少及其品质下降，造成严重的经济损失，并且，目前奶牛乳房炎的治疗主要是使用抗生素，这样就会导致牛奶中含有残留的抗生素，一旦含有抗生素牛奶被人们食用，会出现各种不适的症状，影响消费者的健康，甚至危及人的生命安全。奶牛乳房炎是一种由多种因素引起的疾病，包括病原菌感染、奶牛的生活环境、饲养管理水平、奶牛的个体差异等。其中病原微生物感染是奶牛乳房炎的主要致病因素，据统计已经发现了130多种，其中较常见的有20多种。奶牛乳房炎一般呈混合性感染，其中无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)和大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌和白色念珠菌是最常见的病原菌，引起的奶牛乳房炎病例占总病例的90％左右。
[0003]目前，对于奶牛乳房炎细菌的检测主要还是依靠传统细菌培养、生化鉴定等方法，其操作繁琐、耗时长、敏感性较低，不能适应快速检测的需要。因此，建立一种同时检测多种病原的快速检测技术体系，对奶牛乳房炎的定期检测、混合感染和及时诊断和防治有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种用于鉴别诊断引起奶牛乳房炎主要病原菌DNA的的引物组合物及应用。具体通过以下技术方案实现：
[0005]所述用于检测金黄色葡萄球菌基因组(arcC)的引物组合物包括以下引物：
[0006][0007][0008]所述用于检测无乳链球菌基因(16s)的引物组合物包括以下引物：
[0009][0010]所述用于检测停乳链球菌基因(16s)的引物组合物，包括以下引物：
[0011][0012][0013]所述用于检测炭疽芽孢杆菌基因(pxo1)和蜡状孢杆菌基因(pxo2)的引物组合物，包括以下引物：
[0014][0015]所述用于检测白色念珠菌基因(sod3)的引物组合物，包括以下引物：
[0016][0017][0018]所述的引物还包括将上述各F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。
[0019]本专利技术提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以检测引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因的应用。
[0020]所述的引物组合物在环介导等温扩增(LAMP)方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4
‑
16：4
‑
16：2
‑
8：2
‑
8范围。
[0021]所述的环介导等温扩增反应条件为60
‑
65℃范围。
[0022]本专利技术还提供了上述组合物在用于引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因检测的试剂盒或芯片中的应用，具体为：
[0023]在制备检测引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
[0024]所述的试剂盒或芯片的检测步骤包括：
[0025]1)提取待测细菌或其他类型待检样品中基因组DNA；
[0026]2)以步骤1)提取的基因组DNA为模版，采用上述引物组合物对引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因的环介导等温扩增。
[0027]本专利技术所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因。
[0028]应用上述引物组合物可以对样品中基因DNA模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因；如果不可以对样品中基因DNA模版特异性扩增，则待测样品中不含有金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因。
[0029]本专利技术提供的用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌基因的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测出结果。对于实际应用而言，能够在1小时内获得检测结果。
附图说明
[0030]图1、金色葡萄球菌arcC引物扩增典型荧光曲线(金色葡萄球菌arcC扩增S形曲线，
无乳链球菌16s、停乳链球菌16s、芽孢杆菌pxo和白色念珠菌sod3基因组扩增曲线近乎直线)；
[0031]图2、无乳链球菌16s引物扩增典型荧光曲线(无乳链球菌16s扩增S形曲线，金色葡萄球菌arcC、停乳链球菌16s、芽孢杆菌pxo和白色念珠菌sod3基因组扩增曲线近乎直线)；
[0032]图3、停乳链球菌16s引物扩增典型荧光曲线(停乳链球菌16s扩增S形曲线，金色葡萄球菌arcC、无乳链球菌16s、芽孢杆菌pxo和白色念珠菌sod3基因组扩增曲线近乎直线)；
[0033]图4、芽孢杆菌pxo引物扩增典型荧光曲线(芽孢杆菌pxo扩增S形曲线，金色葡萄球菌arcC、无乳链球菌16s、停乳链球菌16s和白色念珠菌sod3基因组扩增曲线近乎直线)；
[0034]图5、白色念珠菌sod3引物扩增典型荧光曲线(白色念珠菌sod3扩增S形曲线，金色葡萄球菌arcC、无乳链球菌16s、停乳链球菌16s和芽孢杆菌pxo基因组扩增曲线近乎直线)；
具体实施方式
[0035]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0036]下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法。
[0037]使用EasyPure Viral DNA/RNA Kit试剂盒分别提取金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、蜡状芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、白色念珠菌和牛基因组DNA，即为PCR反应的模板。
[0038]实施例1
[0039]将金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、芽孢杆菌、白色念珠菌和牛基因组的DNA用作模板，用金黄色葡萄球菌引物扩增，反应体系如下表；
[0040][0041][0042]金黄色葡萄球菌各引物的核苷酸序列如下：
[0043][0044]结果如图1所示，金黄色葡萄球菌荧光曲线为特异S型曲线，无乳链球菌、停乳链球菌、芽孢杆菌、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌DNA的引物组合物，其特征在于，所述的引物组合物用于检测牛奶中金黄色葡萄球菌arcC基因、无乳链球菌16s基因、停乳链球菌16s基因、芽孢杆菌pxo基因、白色念珠菌sod3基因；所述用于检测引起奶牛乳房炎主要病原菌金黄色葡萄球菌arcC基因的引物组合物包括以下引物：第一组：F3引物为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；B3引物为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；BIP引物为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；第二组：F3引物为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；B3引物为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；BIP引物为SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；所述用于检测无乳链球菌16s基因的引物组合物包括以下引物：第三组：F3引物为SEQ ID No.9所示的核苷酸序列；B3引物为SEQ ID No.10所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；BIP引物为SEQ ID No.12所示的核苷酸序列；LF引物为SEQ ID No.13所示的核苷酸序列；LB引物为SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；第四组：F3引物为SEQ ID No.15所示的核苷酸序列；B3引物为SEQ ID No.16所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.17所示的核苷酸序列；BIP引物为SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；LF引物为SEQ ID No.19所示的核苷酸序列；LB引物为SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；所述用于检测停乳链球菌16s基因的引物组合物包括以下引物：第五组：F3引物为SEQ ID No.21所示的核苷酸序列；B3引物为SEQ ID No.22所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.23所示的核苷酸序列；BIP引物为SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；LF引物为SEQ ID No.25所示的核苷酸序列；LB引物为SEQ ID No.26所示的核苷酸序列；第六组：F3引物为SEQ ID No.27所示的核苷酸序列；
B3引物为SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.29所示的核苷酸序列；BIP引物为SEQ ID No.30所示的核苷酸序列；LB引物为SEQ ID No.31所示的核苷酸序列；所述用于检测芽孢杆菌pxo基因的引物组合物包括以下引物：第七组：F3引物为SEQ ID No.32所示的核苷酸序列；B3引物为SEQ ID No.33所示的核苷酸序列；FIP引物为SEQ ID No.34所示的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯晓林，赵振华，王蕾，刘凤华，周双海，李焕荣，于晓红，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：