新型抗PD-1抗体制造技术

提供了与细胞表面PD

【技术实现步骤摘要】
新型抗PD
‑
1抗体
[0001]本申请是中国专利技术专利申请201980020380.6的分案申请。
[0002]序列表
[0003]本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。


[0004]本申请一般而言涉及抗体。更具体地，本申请涉及与PD
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1特异性结合的单结构域抗体，其制备方法及其用途。

技术介绍

[0005]来自临床前和临床结果的越来越多的证据表明，靶向免疫检查点正在成为治疗癌症患者的最有前途的方法。与CD28具有同源性的免疫球蛋白超家族的抑制成员程序性死亡蛋白1(PD
‑
1)在T细胞、活化的B细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人，同上；Okazaki等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14:391779
‑
82；Bennett等人.(2003)J Immunol 170:711
‑
8)，并且在调节免疫系统中的刺激和抑制信号方面具有关键作用(Okazaki，Taku等人.2007International Immunology 19:813
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824)。PD
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1通过筛选凋亡细胞中的差异表达而被发现(Ishida等人(1992)EMBO J 11:3887
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95)。
[0006]PD
‑
1是I型跨膜蛋白，其是Ig基因超家族的一部分(Agata等人.(1996)bit Immunol 8:765
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72)，并且PD
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1的结构由一个免疫球蛋白可变样胞外结构域和含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基开关基序(ITSM)的胞质结构域组成。虽然在结构上与CTLA
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4相似，但PD
‑
1缺乏对B7
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1和B7
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2结合至关重要的MYPPPY基序。PD
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1具有两种已知的配体，即PD
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L1(B7
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H1，CD274)和PD
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L2(B7
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DC，CD273)，它们是B7家族的表达在细胞表面的成员(Freeman等人(2000)J Exp Med 192:1027
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34；Latchman等人(2001)Nat Immunol 2:261
‑
8；Carter et al(2002)Eur J Immunol 32:634
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43)。PD
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L1和PD
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L2都是与PD
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1结合但不与其他CD28家族成员结合的B7同系物。
[0007]作为免疫检查点蛋白之一的PD
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1是在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达的CD28家族的抑制成员(Agata等人，同上；Okazaki等人.(2002)Curr Opin Immunol 14:391779
‑
82；Bennett等人.(2003)J Immunol 170:711
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8)，并且在限制T细胞的活性方面起主要作用，这提供了肿瘤细胞逃脱免疫监视的主要免疫抗性机制。PD
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1在T细胞中诱导无效能或无反应状态，导致细胞不能产生最佳水平的效应细胞因子。PD
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1也可能通过其抑制存活信号的能力诱导T细胞凋亡。PD
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1缺陷动物发展各种自身免疫表型，包括自身免疫性心肌病和具有关节炎和肾炎的狼疮样综合征(Nishimura等人.(1999)Immunity 11:141
‑
51；Nishimura等人.(2001)Science 291:319
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22)。此外，已经发现PD
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1在自身免疫性脑脊髓炎，系统性红斑狼疮，移植物抗宿主病(GVHD)，I型糖尿病和类风湿性关节炎中发挥作用(Salama等人.(2003)J Exp Med 198:71
‑
78:Prokunina and Alarcon
‑
Riquelme(2004)Hum MoI Genet 13:R143；Nielsen等人.(2004)Lupus 11:510)。在小鼠B细胞肿瘤系中，PD
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1的ITSM显示出对阻断下游效应分子的BCR介导的Ca2+流和酪氨酸磷酸化是必需的(Okazaki等
人.(2001)PNAS98:13866
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71)。
[0008]在活化的T细胞上表达的PD
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1和在肿瘤细胞上表达的PD
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L1的相互作用负调节免疫应答并抑制抗肿瘤免疫。PD
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L1在多种人癌症中大量存在(Dong等人(2002)Nat.Med 8:787
‑
9)。PD
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L1在肿瘤上的表达与食管癌、胰腺癌和其他类型癌症中存活率降低相关，突出显示该途径作为肿瘤免疫治疗的有希望的靶标。几个研究小组已经显示，PD
‑1‑
PD
‑
L1相互作用使疾病恶化，导致肿瘤浸润淋巴细胞的减少，T细胞受体介导的增殖的减少和癌细胞的免疫逃避(Dong等人.(2003)J.MoI.Med.81:281
‑
7；Blank等人.(2005)Cancer Immunol.Immunother.54:307
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314；Konishi等人.(2004)Clin.Cancer Res.10:5094
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100)。通过抑制PD
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1与PD
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L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD
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1与PD
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L2的相互作用也被阻断时，效果是可加成的。
[0009]单结构域抗体(sdAb)是由单个单体可变抗体域组成的抗体。像整个抗体一样，它能够选择性结合特定的抗原。单结构域抗体比由两条蛋白重链和两条轻链组成的常见抗体小得多。第一个单结构域抗体是由骆驼科动物中发现的重链抗体改造而来的(Hamers
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Casterman C，Atarhouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R(1993)Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature 363(6428):446
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448.)；这些被称为VHH片段。目前，对单结构域抗体的大多数研究基于重链可变结构域。
[0010]单结构域抗体具有许多优点。例如，它们通常表现出高溶解度和稳定性，并且还可以容易地在酵母、植物和哺乳动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(例如VHH)的程序性死亡1(PD
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1)结合分子，其中所述VHH包含CDR1、CDR2和CDR3，并且其中CDR1包含与SEQ ID NO：1至少90％相同的氨基酸序列，CDR2包含与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列，和CDR3包含与SEQ ID NO：3至少80％相同的氨基酸序列。2.权利要求1的PD
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1结合分子，其中CDR1在氨基酸序列上与SEQ ID NO：1存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异；CDR2在氨基酸序列上与SEQ ID NO：2存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异；和/或CDR3在氨基酸序列上与SEQ ID NO：3存在不超过2个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异。3.权利要求1的PD
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1结合分子，其中CDR1在氨基酸序列上与SEQ ID NO：1存在1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异；CDR2在氨基酸序列上与SEQ ID NO：2存在1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异；和/或CDR3在氨基酸序列上与SEQ ID NO：3存在1个氨基酸的氨基酸添加、缺失或取代的差异。4.前述权利要求中任一项的PD
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1结合分子，其中所述VHH包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(a)由DSIX1SX2VNMG表示的CDR1，其中X1＝D或Q，并且X2＝M或L；(b)由LIAX3YITHYADFVKG表示的CDR2，其中X3＝N、T、Y、R或W；(c)由RX4IX5X6DY表示的CDR3，其中X4＝N或S，X5＝I、R或Y，并且X6＝V或E。5.前述权利要求中任一项的PD
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1结合分子，其中所述PD
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1结合分子是PD
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1拮抗剂，例如抗PD
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1抗体。6.前述权利要求中任一项的PD
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1结合分子，其中所述VHH包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3：(a)具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR3；(b)具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR3；(c)具有如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的CDR3；(d)具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR3；(e)具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR3；(f)具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的CDR3；(g)具有如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR3；(h)具有如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR3；(i)具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列的CDR3；
(j)具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的CDR3；(k)具有如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR3；和(l)具有如SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR1，具有如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR2和具有如SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR3。7.权利要求1或2的PD
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1结合分子，其中所述VHH包含(A)SEQ ID NO：37
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49中任一个所示的氨基酸序列；(B)与SEQ ID NO：37
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49中的任何一个至少85％、至少90％或至少95％相同的氨基酸序列；或(C)与SEQ ID NO：37
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49中的任何一个相比具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。8.前述权利要求中任一项的PD
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1结合分子，其中所述PD
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1结合分子是单结构域抗体，例如重链单结构域抗体；嵌合抗体；或人源化抗体。9.前述权利要求中任一项的PD
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1结合分子，其中所述VHH来自骆驼科动物，例如羊驼或美洲驼。10.前述权利要求中任一项的PD
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1结合分子，其中所述VHH与另一分子融合，所述另一分子是例如免疫球蛋白(例如IgG)的Fc结构域、荧光蛋白或具有不同...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈蕴颖，李竞，
申请(专利权)人：上海药明生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：