抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种抗人表皮生长因子受体(EGFR)抗体或其抗原结合片段。本发明专利技术进一步提供了包含该抗体或其抗原结合片段的的双特异性分子或多特异性分子、免疫缀合物，以及编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含该核酸分子的载体和宿主细胞。本发明专利技术还提供了制备该抗体或其抗原结合片段的方法、包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及在治疗疾病中使用该抗体或其抗原结合片段，或其药物组合物的方法和用途，本发明专利技术为针对EGFR的抗肿瘤或其它疾病或病症(例如炎症以及自身免疫性疾病)的治疗和/或预防提供了候选的特异性抗体药物。药物。

【技术实现步骤摘要】
抗表皮生长因子受体抗体及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及抗表皮生长因子受体(EGFR)抗体或其抗原结合片段、编码该抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、表达载体及宿主细胞、包含该抗体或其抗原结合片段的药物组合物及其用于治疗对象的用途或方法。

技术介绍

[0002]表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，又称为ErbB
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1或 HER1，是ErbB受体酪氨酸激酶超家族成员之一，它是由原癌基因c
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erbB编码的一种分子量约为170kDa的多功能跨膜糖蛋白，主要由参与配体结合的胞外区胞、跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的胞内区构成，其中胞内区具有酪氨酸激酶活性(Modjtahedi et al.， Br.J.Cancer 73:228
‑
235，1996；Herbst and Shin，Cancer 94:1593
‑
1611，2002)。EGFR的已知配体包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(Transforming Growth Factor
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α， TGF
‑
α)、表皮调节素/EREG和HBEGF/肝素结合EGF、双向调节因子、β细胞素/BTC、上皮细胞有丝分裂蛋白(epigen)/EPGN，EGFR与配体结合后引发EGFR同二聚化或异二聚化，导致EGFR胞内酪氨酸激酶活性区发生自体磷酸化，磷酸化的EGFR募集衔接蛋白(例如GRB2)随之激活下游信号传导途径，进而调控多种细胞生理过程，例如，通过 Ras诱导的MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路(例如，RAS
‑
RAF
‑
MEK
‑
ERK)来调控细胞的增殖、分化、凋亡、炎症反应以及血管生成等生物学功能，通过磷脂酰肌醇3
‑ꢀ
激酶(PI3K)信号通路(PI3激酶
‑
AKT)来调控细胞增殖和存活、细胞骨架重组、膜运输、细胞粘附和运动、血管再生及胰岛素作用，以及通过JAK/STAT途径来调控血液细胞对细胞因子的反应以及参与细胞发育、分化、增殖、凋亡和免疫调节等重要生物学过程(Atalay 等，Ann.Oncology 14：1346
‑
1363(2003)；Tsao和Herbst,Signal 4：4
‑
9(2003)；Herbst和 Shin,Cancer 94：1593
‑
1611(2002)；Modjtahedi等，Br.J.Cancer 73：228
‑
235(1996))。通过EGFR的配体结合也可以激活NF
‑
κ
‑
B信号传导级联，进而参与机体的炎症反应、免疫应答和调节细胞凋亡以及应激反应。EGFR与配体结合也可以直接磷酸化其它蛋白(例如 RGS16)，从而激活其GTP酶活性，并可能将EGF受体信号传导至G蛋白偶联的受体信号传导。EGFR与配体结合还可以使MUC1磷酸化并增加其与SRC和CTNNB1/β
‑
连环蛋白(catenin)的相互作用等，进而调控细胞生长和细胞粘附等生物学功能。
[0003]研究表明在多种实体肿瘤(例如，非小泡细胞肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、头颈癌、食道癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、肾癌等(Woodburn JR，PharmacolTher 1999；82:241
‑
50；Yarden Y，Eur J Cancer 2001；37:S3
‑
S8；Mendelsohn J等，Oncogene 2000；19:6550
‑
65))中存在EGFR高表达或异常表达，EGFR信号通路发生异常的可能机制包括EGFR过表达、EGFR突变、自分泌环的作用增强、配体表达的增加、受体下调机制的破坏、异常信号转导通路的激活等(Roza Zandi等，CellularSignalling,2007,19:2013
‑
2023)。EGFR在肿瘤细胞膜上的过度表达和/或增殖与肿瘤患者的不良预后、降低了的生存期和更高的肿瘤侵袭性相关。此外，EGFR也在正常组织(例如，皮肤、肝和胃肠道的上皮
组织)中表达，但表达水平远低于肿瘤组织(Herbst和Shin， Cancer 94：1593
‑
1611(2002))。
[0004]目前，靶向EGFR胞外域部分的单克隆抗体包括西妥昔单抗(Cetuximab，又称为 IMC
‑
225，Erbitux)、帕尼单抗(Panitumumab，又称为ABX
‑
EGF)、耐昔妥珠单抗 (Necitumumab，又称为IMC
‑
11F8)和Matuzumab(EMD72000)，可阻断EGFR受体与配体的结合进而抑制配体介导的EGFR酪氨酸激酶的活化或干扰EGFR二聚化的形成，由于阻断了受体
‑
配体结合，处于肿瘤微环境中的肿瘤细胞或基质细胞中的EGFR信号传导途径所调控的肿瘤细胞生理过程被中断，从而抑制肿瘤细胞的生长、诱导凋亡、减少基质金属蛋白酶和血管上皮生长因子的产生，进而发挥抗肿瘤的作用(Fan Z等，1994；AbanellJ等，2001；Prewett M等，1996；Huang SM等，1999；Fan Z等，1993a；Fan Z等，1993b)。此外，西妥昔单抗和耐昔妥珠单抗还会诱导EGFR内化和降解，引发EGFR
+
肿瘤细胞发生抗体依赖性细胞毒性(antibody
‑
dependent cell
‑
mediated cytotoxicity,ADCC)(Kawaguchi Y 等，1996；Kimura H等，2007)。ADCC取决于细胞FcγR与单克隆抗体之间的相互作用，触发包括NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、活化的T淋巴细胞以及粒细胞的先天免疫反应。受体内化下调可用的细胞表面受体的数量，并且可以因此影响EGFR活化。尽管帕尼单抗是采用转基因小鼠技术制备的全人源单克隆抗体，其作用机制为竞争性与肿瘤细胞上 EGFR结合，阻断EGFR与配体EGF和TGFa结合，诱导EGFR内化，消除由EGFR介导的细胞效应，但是当帕尼单抗应用到人体内时可显著降低人鼠嵌合抗体的免疫原性，但是帕尼单抗是IgG2亚型抗体，与IgG1相比，IgG2的ADCC和/或CDC活性明显降低，以及IgG2亚型抗体的稳定性较差，这可能是在临床疗效方面帕尼单抗与西妥昔单抗相比没有显著优势的原因。
[0005]尽管目前已有上市了的靶向EGFR的抗体以及已有不少EGFR抗体正处于临床试验研究阶段，但是现有的抗体对EGFR+肿瘤的治疗并不是始终有效的，例如西妥昔单抗和帕尼单抗只对EGFR表达的KRAS野生型肿瘤有治疗效果，而对KRAS突变的肿瘤不具有抑制作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人表皮细胞生长因子(EGFR)抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，所述的重链可变区具有CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述重链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区包含当由IMGT编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：1、2和3；或当由Kabat编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：9、10和11；或当由Chothia编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：14、15和11；或当由Contact编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：16、17和18所示的具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列；所述的轻链可变区具有CDR1区、CDR2区和CDR3区，所述轻链可变区的CDR1区、CDR2区和CDR3区包含当由IMGT编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：4、5和6；或当由Kabat或Chothia编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：12、13和6；或当与Contact编号系统定义时，分别与SEQ ID NOs：19、20和21所示的具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区和轻链可变区包含分别与SEQ ID NOs:7和8具有至少85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，进一步包含免疫球蛋白恒定区，可选的是人IgG的恒定区。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其具有以下一个或多个特征，(1)特异性结合至人EGFR胞外结构域(ECD)，通过ELISA检测其EC50值不超过1nM，优选的是不超过0.5nM；(2)与其它人ErbB受体酪氨酸激酶不具有交叉反应活性，所述其它人ErbB受体酪氨酸激酶包括HER2、HER3和/或HER4；(3)对表达EGFR的肿瘤细胞增殖活性具有抑制作用，通过ELISA检测所述抗EGFR抗体或其抗原结合片段对肿瘤细胞的IC50值不超过1nM，优选不超过0.5nM；(4)与人EGFR胞外结构域(ECD)结合亲和力常数(KD)数值不超过5
×
10
‑8M，优选的KD值不超过1
×
10
‑8M。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，可以是小鼠、人、嵌合或人源化抗体。6.一种核酸，其编码权利要求1
‑
5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。7.一种表达权利要求6所述核酸的表达载体。8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的表达载体。9.一种使用权利要求8所述的宿主细胞制备权利要求1
‑
5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含以下步骤(1)在所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合
片段，和(2)从所述的宿主细胞或细胞培养物中分离所述的抗体或其抗原结合片段。10.一种双特异性分子或多特异性分子，其包含权利要求1
‑
5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及对Fc受体、或者与癌症相关的抗原或免疫检查点蛋白抗原具有结合特异性，其中所述的与癌症相关的抗原选自HER2、HER3、VEGF、VEGFR、c
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Met、TFR(转铁蛋白受体)、IGF
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1R(人胰岛素
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样生长因子I受体)；所述免疫检查点蛋白抗原选自PD
‑
1、PD
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L1、CTLA
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4、CD137、CD47。11.如权利要求10所述的双特异性抗体或多特异性抗体，其进一步可以包含第三结合特异性，第三特异性可以是抗增强因子(EF)部分。12.一种免疫缀合物、嵌合抗原受体、工程化T细胞受体、或溶瘤病毒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：J﹒Y﹒李，
申请(专利权)人：徕特康苏州生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：