本发明专利技术属于蛋白质或多肽检测领域，公开了利用正反馈酶反应放大体系检测痕量蛋白质或多肽的方法。该方法为对待测痕量蛋白质或多肽采用结合了正反馈酶促反应放大体系和酶反应动力学分析方法的酶联免疫吸附检测方法。该方法检测灵敏度可达１～５０ｆｍｏｌ／Ｌ，比常规ＥＬＩＳＡ的灵敏度提高４～５个数量级。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质或者多肽检测领域，涉及一种灵敏度高的利用正反馈酶反应放 大体系检测痕量蛋白质或多肽的方法。
技术介绍
自从1971年Engvall等1专利技术ELISA以来，这项技术已经广泛地应用于基础研究 和临床诊断，其特点是特异性强、重复性好、操作简便、不需要大型特殊仪器。从八十年代以来，科学家就从多方面探索提高ELISA检测灵敏度的方法，其中放 大体系的引入效果最为明显，诸如碱性磷酸酶与辅酶I放大体系2_4，凝血因子放大体系 (ELCA) 5_9，生物素-亲和素放大体系1(1，都极大的提高了普通ELISA的检测灵敏度。随着蛋白质组学和临床诊断的发展，对ELISA检测灵敏度的要求不断提高。血浆 中某些痕量蛋白质或者多肽的浓度变化对疾病的预测以及诊断具有重要意义。比如人血浆 中B型促尿钠排泄肽(BNP)的浓度对于心力衰竭(HF)病人的诊断、分级、临床检测以及预 后等都有重要意义"_14，而BNP在血浆中的浓度非常低(10 100pg/ml)，对检测灵敏度的要 求很高。最新的一项人血浆蛋白质组研究15确认了血浆中存在4590种蛋白，表明了人血浆 中存在着数目庞大的极低丰度蛋白，要进一步研究这些极低丰度蛋白的功能就必须建立一 套极为灵敏的检测方法。但是，蛋白质的痕量检测仍存在一定的困难，一个最主要的原因是 缺乏像检测核酸的PCR那样高灵敏度的、可对目标蛋白进行扩增的技术。目前，尚未有采用 正反馈酶反应放大体系结合酶反应动力学分析方法检测痕量蛋白质或多肽的ELISA方法。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种灵敏度高的利用正反馈酶反应放大体系结合酶反应动力 学分析方法检测痕量蛋白质或多肽的ELISA方法。本专利技术另一个目的是提供一种正反馈酶反应放大体系。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的一种检测痕量蛋白质或多肽的方法，该方法为对待测痕量蛋白质或多肽采用结合 了正反馈酶促反应放大体系和酶反应动力学分析方法的酶联免疫吸附检测方法。所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中对待测痕量抗原蛋白质或者多肽进 行ELISA检测；用于检测抗原蛋白质或者多肽的检测抗体用尿激酶标记；建立一个由纤溶 酶原和尿激酶原或者尿激酶原突变体M5，以及标记检测抗体的尿激酶组成的正反馈酶促 反应放大体系；通过酶反应动力学分析方法，使用纤溶酶的合成发色底物或者荧光小分子 底物测定正反馈酶促反应放大体系中产生的纤溶酶的量，反应出标记检测抗体的尿激酶的 量，从而得出待测蛋白质或多肽的含量。所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中正反馈酶反应放大体系是纤溶酶原 和尿激酶原或者尿激酶原突变体M5的混合物在标记检测抗体的尿激酶的催化下，通过不 断互相催化的正反馈酶促反应，产生可用酶动力学方法检测到的纤溶酶。3所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中对检测抗体用尿激酶标记是使用 SMPT共价连接检测抗体的氨基和尿激酶的链间巯基，得到检测抗体和尿激酶的共价偶联 物。所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中使用0. 2mmol/L的β -巯基乙醇还 原尿激酶链间二硫键，产生可反应的链间巯基，而不影响与尿激酶活性相关的链内二硫键。所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中纯化检测抗体与尿激酶共价偶联 物的方法是将含检测抗体与尿激酶共价偶联物的溶液上Protein G亲合层析柱，使用 0. lmol/L, pH2. 8的甘氨酸溶液洗涤除去未偶联的检测抗体，使用含有0. 5mol/L氯化钠的 0. lmol/L, pH2. 8的甘氨酸溶液洗脱得到检测抗体和尿激酶的共价偶联物。所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中纤溶酶的合成发色底物为发色底物 S2251 ；荧光小分子底物为 H-D-Val-Leu-Lys-AMC。一种尿激酶原突变体M5，该突变体是天然尿激酶原的氨基酸序列中第300位赖氨 酸被组氨酸代替。所述的检测痕量蛋白质或者多肽的方法，其中纤溶酶原的制备方法是使用赖氨酸 亲合层析柱从人新鲜血浆中分离纯化纤溶酶原，在层析过程的所有溶液以及血浆中加入苯 甲基磺酰氟。一种正反馈酶促反应放大体系，该体系由纤溶酶原和尿激酶原或者尿激酶原突变 体M5，以及尿激酶组成；纤溶酶原在尿激酶的催化下转化为纤溶酶，产生的纤溶酶使体系 中的尿激酶原或者尿激酶原突变体M5转化为尿激酶，尿激酶又继续催化纤溶酶原转化为 纤溶酶，从而产生更多的纤溶酶，形成一个正反馈不断放大的酶促反应体系。本专利技术的技术核心在于一种由纤溶酶原、尿激酶原或者其突变体、尿激酶组成的 正反馈酶反应放大体系(如图1所示)，该体系由一对具有正反馈相互作用的蛋白酶一 纤溶酶原和尿激酶原或者其突变体组成，尿激酶是作为该体系的触发剂。通常，不高于 2 μ mol/L的纤溶酶原与不高于40pmol/L的尿激酶原或者其突变体的混合体系是一个相对 稳定的酶体系，当有痕量尿激酶进入该体系，即可加速整个酶促反应过程。即痕量尿激酶可 使纤溶酶原转化为纤溶酶，产生的纤溶酶使体系中的尿激酶原转化为双链尿激酶，双链尿 激酶又可继续催化纤溶酶原转化为纤溶酶，从而产生更多的纤溶酶，因此形成一个正反馈 不断放大的过程。使用灵敏的酶动力学分析方法来检测体系中产生的纤溶酶，从而反映出 尿激酶的量。当用于ELISA反应时，通过包被捕获抗体，封闭非特异性位点，洗涤后，加入待 检测抗原溶液孵育。洗去抗原溶液后，加入标记有尿激酶的检测抗体，充分洗涤，再加入上 述的正反馈酶反应放大体系，最终使用酶反应动力学分析方法测定体系中纤溶酶的量，从 而反映出偶联有尿激酶的检测抗体的量，因此可以计算出待检测抗原的浓度。本专利技术的特点还在于ELISA中的检测抗体和尿激酶的共价偶联，通过使用 0. 2mmol/L的β -巯基乙醇对尿激酶进行部分还原，即只还原尿激酶的链间二硫键，产生可 反应的链间巯基，而不影响与其活性密切相关的链内二硫键，因此具有尿激酶催化活性中 心的轻链部分可以通过巯基与经过SMPT (4-琥珀酰亚胺氧羰基-甲基-a 代甲苯，4-succinimidyloxycarbonyl-methyl_a- (2-pyridyldithio) -toluene) 白勺 ^ 测抗体结合。本专利技术在正反馈酶反应放大体系中采用了一种尿激酶原突变体(Μ5)，它具有天然尿激酶原的氨基酸序列，但对其第300位的赖氨酸进行突变，变成组氨酸，该突变可使其内 在酶活性比天然尿激酶原低4倍以上，并使其双链活性是尿激酶的2倍。当此突变体用于 正反馈酶反应放大体系中时，其较低的内在酶活性保证了其与纤溶酶原混合体系的相对稳 定性，在其被转化成双链尿激酶之后，又能以更快的速度催化纤溶酶原转化为纤溶酶，进一 步提高整个正反馈酶反应放大体系的效率。本专利技术的有效效果本专利技术为了提高痕量蛋白质或多肽检测的灵敏度，提出一种联合应用ELISA、正 反馈酶促反应放大体系和酶反应动力学分析来提高检测灵敏度的方法，其检测灵敏度达到 1 50fmol/L，比常规ELISA的灵敏度提高4 5个数量级。本专利技术设计的正反馈酶反应 放大体系和目前任何已报道的方法均不相同。附图说明图1是ELISA、正反馈酶反应体系的示意图。方框内表示由纤溶酶原、尿激酶原、尿 激酶组成的正反馈酶反应放大体系。图2是26E2-UK SDS-PAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测痕量蛋白质或多肽的方法，其特征在于该方法为对待测痕量蛋白质或多肽采用结合了正反馈酶促反应放大体系和酶反应动力学分析方法的酶联免疫吸附检测方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘建宁，毕锋，
申请(专利权)人：南京大学生物制药工程研究中心，
类型：发明
国别省市：32
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