使用加工酶的嵌合蛋白质的切断方法技术

提供一种包含目的蛋白质的嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质利用加工酶能容易地开裂，能高效率地回收目的蛋白质，是以下式表示的嵌合蛋白质：＄Ａ－Ｌ－Ｂ。＄式中，Ａ是保护肽，Ｂ是目的肽，Ｌ是接头肽，在其Ｃ末端部分具有序列Ｘ１－Ｘ２－（Ｔｒｏ、Ｌｙｓ或Ａｒｇ）－Ａｒｇ（式中，Ｘ１和Ｘ２是任意的氨基酸），而在Ｎ末端具有富有Ｈｉｓ的部分。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是关于在生产生理活性肽或其前体时，成为底物的嵌合蛋白质及其生产方法，本专利技术进而是关于使该生理活性肽从该嵌合蛋白质中游离、精制的方法。正在利用嵌合蛋白质表达法尝试许多的肽生产方法。作为目的肽的游离方法，正在使用利用化学的或酶的切断。作为酶有特异地切断赖氨酸残基的C末端侧的肽键的赖酰胺肽链内切酶(无色杆菌蛋白酶I)、特异地切断谷氨酸残基的C末端侧的葡萄球菌蛋白酶V8等。作为化学方法有亚硝酸引起天冬氨酸残基开裂、CNBr引起甲硫氨酸残基开裂等。化学方法不能避免目的肽的修饰，在切断后的目的肽的精制中，必须从各种类似物中进行目的肽的精制。而酶切断方法特异性高、也可在较温和的条件下进行切断，因此目的肽的精制是容易的，但是是否可能利用这些酶，要依赖于目的肽的氨基酸序列。因此存在不能选择现有蛋白酶，而寻求通用性高的切断酶。在生物体内生成肽激素及其前体时，用酶(加工酶)特异地切断该肽的前体多肽。在这种酶中已经知道前体转变酶1/3(PC1/3)、前体转变酶2(PC2)、フリン(furin)等，在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)的α-因子(α-mating factor)生成时发挥功能的Kex2蛋白酶也是其中一种。在从嵌合蛋白质中切出目的肽时如果直接使用这些加工酶，能不损害肽激素，而且能够适用于各种各样肽，正期待像这样的生产方法。本专利技术人已报导过以来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的多肽作为保护肽，选择合适的接头肽，在大肠杆菌体内以不溶性包涵体生产与目的肽嵌合的蛋白质的方法(特开平5-328992)。该嵌合蛋白质用尿素等变性剂溶解，成为加工酶的底物。另一方面，本专利技术人等已报导过通过变化其基因、作为可溶性酶(分泌型Kex2衍生物)生产来自膜结合型酶的啤酒糖酵母的Kex2蛋白酶的方法(“分泌型Kex2衍生物的制造方法”为题的平成8年3月4日申请的说明书)。但是，在以该酶作为加工酶使用时，未涉及关于成为其底物的嵌合蛋白质的设计。因此，正期待开发在大量培养下、在大肠杆菌体内作为包涵体能效率良好地生产、在加工酶有效地作用条件下能容易溶化的嵌合蛋白质的设计、生产方法，进而期待开发利用加工酶从嵌合蛋白质中有效地切断目的肽那样地设计、生产切断部位附近的氨基酸序列的方法。另外，同时也期待开发以高回收率将像上述那样生产的生理活性肽精制至99％以上的纯度的通用性的高精制方法。因此，本专利技术想要提供在使用如分泌型Kex2衍生物的加工酶、生产生理活性肽时成为底物的嵌合蛋白质的设计、生产方法及该肽的精制方法。本专利技术人等研究了解决上述课题的方法，结果初次清楚以下事实，从而完成了本专利技术。即1)在嵌合蛋白质中插入富有His的序列，例如含有{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)的接头肽，与产量增加和在如分泌型Kex2衍生物的加工酶反应条件下的溶解性提高有关的事实，2)以接头内的加工酶作用部位的氨基酸序列作为X1-X2-(Lys/Arg)-Arg，希望作为X1选择Lys、Arg或His，作为X2选择His或Phe，是反应性高的底物条件的事实，进而3)反应后，使反应液的pH变成弱酸性，再进行稀释，使变性剂的浓度降低，使目的肽以外的成分的大部沉淀，通过离心分离或压滤，在上清液中能够回收95％以上的目的肽，然后例如单独或者最好组合使用阳离子交换色谱法、低压反相色谱法、反相HPLC等能够高纯度且高回收率地精制目的肽的事实。因此本专利技术提供以下式表示的嵌合蛋白质，A-L-B(式中，A是保护肽；B是目的肽；而L是接头肽，在其C末端具有序列X1-X2-(Lys或Arg)-Arg(式中，X1和X2是任意的氨基酸)，而在N末端具有富有His的部分。]作为在上述N末端富有His的部分，序列n(式中，n是1-6)是理想的，并且X1是Arg、Lys或者His，而且X2是His或者Phe为佳。进而，在上述N末端部分的氨基酸序列和上述C末端部分的氨基酸序列之间也可以存在1-5个任意的氨基酸。本专利技术还提供以下述为特征的方法，即在上述的嵌合蛋白质的制造方法中，用含有编码该嵌合蛋质的DNA的表达载体转化宿主细胞，培养得到的转化体，从该培养物中提取上述嵌合蛋白质。本专利技术又提供以下述为特征的方法，即在上述目的肽(B)的制造方法中，使加工酶作用于上述的嵌合蛋白质，而切断接头肽(L)的C末端和目的肽(B)的N末端之间的肽键，得到目的肽(B)。上述的方法，在优选的方式中，用能够表达编码嵌合蛋白质的基因的载体转化宿主细胞，培养得到的转化体，再破碎该转化体，得到包涵体的不溶性级分，用可溶化剂处理该不溶性级分，使包涵体中的嵌合蛋白质溶化，用如分泌型Kex2衍生物的加工酶切断该溶化的嵌合蛋白质的上述接头氨基酸残基的C末端和上述目的肽的N末端之间的肽键，从而切出该目的肽，通过沉淀处理、阳离子交换色谱法、低压反相色谱法和反相HPC精制该目的肽。对附图的简要说明附图说明图1表示在合成hProPTH(1-84)基因制作中使用的合成低聚物的序列。图2表示合成hProPTH(1-84)基因的制作方法。图3是表示质粒pG210S(S/X)的制作方法的图。Plac表示大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子，Ttrp表示大肠杆菌的TrPE的减弱终止区。图4表示表达嵌合蛋白质βGal-139S(FM)PPH84的质粒pGP#139的制作方法。图5表示表达嵌合蛋白质βGal-139S(FM)PPH84的质粒pGP#19PP34的制作方法。图6是表示表达嵌合蛋白质βGal-117SPPH34和βGal-117SnHPP34的质粒pG117SPPH34和pG117SnHPPH34的制作方法的前半部分的图(n＝1-6)。使引物S05转变成S04制成pG97SPPH34和pG97SnHPPH34，使引物S05转变成S06，制成pG139SPPH34和pG139SnHPPH34。图7是表示表达嵌合蛋白质βGal-117SPPH34和βGal-117SnHPP34的质粒pG117SPPH34和pG117SnHPPH34的制作方法的后半部分的图(n＝1-6)。使引物S05转变成S04制成pG97SPPH34和pG97SnHPPH34，使引物S05转变成S06，制成pG139SPPH34和pG139SnHPPH34。图8是表示调查聚组氨酸接头{(His)4-Pro-Gly}n(n＝1-6)对嵌合蛋白质产量影响的SDS-PAGE的结果的图。图中4H表示组氨酸残基是4个即n＝1。图9是表示聚组氨酸接头n(n＝1-6)对由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影响的图。横轴表示以βGal-117SPPH34的Kcat值作为1时的相对值。图10是表示Kex2蛋白酶的识别部位P3的氨基酸对由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影响的图。P4的氨基酸固定在缬氨酸残基上，取代P3部位的氨基酸。横轴表示以βGal-117S4HVKPH34的Kcat值作为1时的相对值。图11是表示Kex2蛋白酶的识别部位P4的氨基酸对由Kex2-660引起的hPTH(1-34)的切出效率影响的图。P3的氨基酸固定在组氨酸残基上，取代P4部位的氨基酸。横轴表示以βGal-117S4HVKPH34的Kcat值本文档来自技高网...

【技术保护点】
由下式表示的嵌合蛋白质， Ａ－Ｌ－Ｂ 式中，Ａ是保护肽； Ｂ是目的肽； Ｌ是接头肽，在其Ｃ末端部分具有序列：Ｘ１－Ｘ２－（Ｐｒｏ、Ｌｙｓ或Ａｒｇ）－Ａｒｇ（式中，Ｘ１和Ｘ２是任意的氨基酸），而且在Ｎ末端具有富有Ｈｉｓ的部分。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木雄司，孙田浩二，增田丰文，
申请(专利权)人：第一三得利制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]