一种2,3-丁二醇脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种2,3

【技术实现步骤摘要】
一种2,3
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丁二醇脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种2,3
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丁二醇脱氢酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]2,3
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丁二醇是极具价值的平台化合物，其脱羧化反应合成的乙偶姻和双乙酰可以作为食品风味添加剂，在食品、医药和能源等领域都有着广泛的应用。乙偶姻的结构为3
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羟基
‑2‑
丁酮(acetoin)是最小的天然手性α
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羟基酮，具有一个手性中心，以(R)
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乙偶姻和(S)
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乙偶姻两种立体异构体存在。目前，乙偶姻已经被作为添加剂、防腐剂、植物生长促进剂。同时，乙偶姻被美国能源部列为优先开发的30大潜在化合物之一，广泛应用于食品、化妆品，特别是光学活性药物和液晶的不对称合成中。乙偶姻在食品调香、生化及药理方面有着广泛的应用价值，目前国内外对其合成和生产都有着比较深入的研究。自然界中的某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2,3
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丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。
[0003]随着石油燃料的稀缺，生物基化学品与生物制品引起了人们越来越多的关注。2,3
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丁二醇/乙偶姻及其衍生物是一类非常重要的手性化合物，在精细化学品以及手性药物的合成方面具有极其重要的应用价值。
[0004]目前工业上乙偶姻的生产方法是化学合成法及生物合成法。其中化学合成法存在成本昂贵，环境污染严重、制备周期长等问题。与之相比，生物合成法制备2,3
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丁二醇/乙偶姻的更加符合可持续绿色发展的原则，近年来引起了研究者的广泛关注。通过微生物发酵生产2,3
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丁二醇/乙偶姻的方法大大降低了生产成本，但是发酵法存在副产物积累以及产量低等问题。因此，从天然菌株中克隆表达2,3
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丁二醇脱氢酶或乙偶姻还原酶的酶学方法具有更加广阔的发展空间，通过生物酶催化生产的2,3
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丁二醇/乙偶姻具有非常大的应用前景。
[0005]现有的酶法生产2,3
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丁二醇/乙偶姻的研究还处于发展阶段，目前已有的2,3
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丁二醇脱氢酶存在酶活低等问题，仍然难以满足工业化制备2,3
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丁二醇/乙偶姻的要求，因此需要开发具有显著提高工业应用性的生物酶催化剂，来进一步提高目标产品的产量，推进酶法合成2,3
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丁二醇/乙偶姻的工业化应用进程。

技术实现思路

[0006]本专利技术从粘质沙雷氏菌(Serratia mapcescens)来源的2,3
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丁二醇脱氢酶(简称BDH，e.c.1.1.1.4)出发，旨在通过定点突变对该基因进行改造，提高SmBDH的酶活力，以期进一步提高2,3
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丁二醇/乙偶姻的产量，为工业化生产奠定基础。
[0007]为解决酶法转化合成2,3
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丁二醇/乙偶姻效率低下，2,3
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丁二醇脱氢酶活性低等
问题，本专利技术提供了定点突变提高2,3
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丁二醇脱氢酶活性的方法。
[0008]为解决2,3
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丁二醇脱氢酶酶活低下的问题，本专利技术通过定点突变，获得了多个单点突变的2,3
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丁二醇脱氢酶，通过NADH生成/消耗对其进行测活，筛选出催化活力明显提高的突变体：V90I、V92I、A93Q、R106K、K185R、G191D、E195D、I196L、R197L、A209P、A241L、D245N、D245S、D245C和D245T。其中，突变体简写代表如下：V90I代表：第90位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸；其他同理。
[0009]本专利技术提供了一种2,3
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丁二醇脱氢酶突变体，是由来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的野生型2,3
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丁二醇脱氢酶进行突变而得，所述野生型2,3
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丁二醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体突变为以下任意一种：
[0010](1)第90位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸；
[0011](2)第92位氨基酸由缬氨酸突变位异亮氨酸；
[0012](3)第93位氨基酸由丙氨酸突变位谷氨酰胺；
[0013](4)第106位氨基酸由精氨酸突变位赖氨酸；
[0014](5)第185位的氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸；
[0015](6)第191位的氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸；
[0016](7)第195位的氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸；
[0017](8)第196位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸；
[0018](9)第197位的氨基酸由精氨酸突变为亮氨酸；
[0019](10)第209位的氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸；
[0020](11)第241位的氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸；
[0021](12)第245位的氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺；
[0022](13)第245位的氨基酸由赖氨酸突变为丝氨酸；
[0023](14)第245位的氨基酸由赖氨酸突变为半胱氨酸；
[0024](15)第245位的氨基酸由赖氨酸突变为苏氨酸。
[0025]本专利技术还提供了所述2,3
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丁二醇脱氢酶突变体在生产2,3
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丁二醇/乙偶姻中的应用。
[0026]本专利技术还提供了编码所述2,3
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丁二醇脱氢酶突变体的基因。
[0027]本专利技术还提供了所述的基因在生产2,3
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丁二醇/乙偶姻中的应用。
[0028]本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的表达载体。
[0029]本专利技术还提供了所述表达载体在生产2,3
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丁二醇/乙偶姻中的应用。
[0030]本专利技术还提供了一种表达权利要求1所述2,3
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丁二醇脱氢酶的基因工程菌。
[0031]本专利技术还提供了所述基因工程菌在生产2,3
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丁二醇/乙偶姻中的应用。
[0032]本专利技术的有益效果：
[0033]本专利技术对SmBDH序列进行了定点突变改造，提高了其氧化还原酶活。与野生型相比，本专利技术涉及的突变体，以D245C、D245S突变体活性提高最为显著，其氧化酶活达128.77U/mg、56.44U/mg，为野生型酶活(16.86U/mg)的7.64倍、3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种2,3
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丁二醇脱氢酶突变体，其特征在于，是由来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的野生型2,3
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丁二醇脱氢酶进行突变而得，所述野生型2,3
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丁二醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体突变为以下任意一种：(1)第90位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸；(2)第92位氨基酸由缬氨酸突变位异亮氨酸；(3)第93位氨基酸由丙氨酸突变位谷氨酰胺；(4)第106位氨基酸由精氨酸突变位赖氨酸；(5)第185位的氨基酸由赖氨酸突变为精氨酸；(6)第191位的氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸；(7)第195位的氨基酸由谷氨酸突变为天冬氨酸；(8)第196位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸；(9)第197位的氨基酸由精氨酸突变为亮氨酸；(10)第209位的氨基酸由丙氨酸突变为脯氨酸；(11)第241位的氨基酸由丙氨酸突变为亮氨酸；(12)...

【专利技术属性】
技术研发人员：于浩然，曹佳雯，蒲中机，丁豪特，龙尚霖，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：