一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，利用细胞核原位Tn5酶切反应构建单细胞转录组文库，简化了转录组文库构建中cDNA扩增步骤，不需要第二链的合成，缩短了实验流程；通过第一轮标签序列添加，实现多样本混样单批次建库；通过两轮标签序列的添加，实现单芯片多倍过载上样，提高了单次反应可检测的样品数量和细胞数量，大大降低了单细胞文库的制备成本。本发明专利技术还提高了反应效率和测序数据质量，单次反应可检测的细胞数量大大增加，单细胞可检出基因数显著提高。本发明专利技术还提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，使用自主研发的反应试剂体系，降低了单细胞文库的制备成本，具有较高的普遍适用性。高的普遍适用性。高的普遍适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法。

技术介绍

[0002]单细胞转录组测序技术对阐明组织中复杂多样的细胞个体在发育和功能等方面的异质性具有重要作用。目前领域内有多种单细胞转录组方法，其中使用最为广泛的是SMART
‑
Seq2(Switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术和10
×
Genomics公司的相关试剂盒。
[0003]SMART
‑
seq2在分选得到单细胞后，以oligo(dT)VN为引物进行逆转录，生成cDNA第一链；当逆转录酶到达mRNA 5'末端时，会在末端添加几个连续的胞嘧啶(C)残基；然后通过模板转换引物TSO结合cDNA，合成第二条链；cDNA双链经过PCR扩增纯化后用于测序。其操作繁琐，实验周期长。10
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Genomics公司依赖于自有商业平台，开发了一系列单细胞转录组测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：对待测细胞进行固定，之后进行细胞膜透化；利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在透化后的待测细胞的细胞核中原位逆转录合成mRNA
‑
cDNA杂合双链；提供Tn5转座子，在所述mRNA
‑
cDNA杂合双链上添加接头；提供含有核酸外切酶和逆转录酶的逆转录酶反应体系，将添加接头反应之后多余的引物去除并补齐Tn5酶切产生的双链缺口；反应完成后，在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴；利用特定预扩增引物对含有过载的待测细胞的高通量微滴进行文库预扩增，得到预文库；利用针对待测细胞的特异性引物2对所述预文库进行最终扩增并添加第二轮样本标签序列；将最终扩增产物回收后，得到所述的单细胞转录组测序文库。2.根据权利要求1所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体。3.根据权利要求2所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述修饰后的寡核酸双链为5
’‑
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
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‑
C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。4.根据权利要求1所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述特异性逆转录引物1包含针对待测细胞的384条逆转录引物，用于样本的第一轮标记；所述特异性引物2包含针对待测细胞的4条样本扩增引物，用于最终扩增时样本的第二轮标记。5.根据权利要求4所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述逆转录引物的碱基序列中包含8bp的索引序列。6.根据权利要求1所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴的具体步骤为：对多个样本计数后，按比例混合，在带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台上以过载的形式上机，构建含有过载的待测细胞的高通量微滴。7.一种多样本超...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈曦，徐玮，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：