本发明专利技术涉及一种新城疫病毒Ｉｔａｌｉｅｎ株ＨＮ蛋白和Ｆ蛋白及其在基因治疗药物中的应用，包括ＮＤＶ？Ｉｔａｌｉｅｎ株的ＨＮ基因和Ｆ基因的ｃＤＮＡ以及ＮＤＶ？Ｉｔａｌｉｅｎ株的ＨＮ蛋白和Ｆ蛋白氨基酸序列。本发明专利技术的有益效果是：得到了可以单独或串联表达ＮＤＶ？Ｉｔａｌｉｅｎ株ＨＮ和Ｆ基因的真核表达质粒或重组病毒颗粒，使这两种基因能够在真核细胞，包括人体的肿瘤细胞、转化细胞或异常细胞中同时表达其编码产物ＨＮ蛋白和Ｆ蛋白，并且这两种蛋白可以导致感染细胞与细胞之间融合形成多核巨细胞，最终产生细胞死亡的细胞毒效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种新城疫病毒NDV-Italien株的唾液酸-神经 氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN蛋白)禾口融合蛋白(fusion protein,F蛋白) 及其在基因治疗药物中的应用。
技术介绍
新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)是副粘病毒科副粘病毒属的单股 负链RNA病毒，通常感染禽类导致新城疫。由于该病毒对人类无致病源性，因此，近年来用 于肿瘤治疗。NDV的RNA基因组全长约15kb，包含6个基因，编码六种结构蛋白，其中的血 凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase, HN)能够识别宿主细胞膜上的含 唾液酸的糖蛋白受体，并和病毒的融合蛋白(fusion protein, F)相互作用，促使病毒进入 宿主细胞。同时更重要的是，感染了病毒的细胞其表达的HN和F蛋白促使肿瘤细胞与细胞 之间发生融合，进而形成多核细胞，最终细胞走向死亡。以往的研究多从病毒分子生物学角 度，探讨HN蛋白和F蛋白的相互作用介导病毒对宿主细胞的入侵，或从畜牧业领域研究HN 作为病毒的保护性抗原，从而制备针对NDV的疫苗预防新城疫的感染。对F蛋白的研究也 主要集中于HN和F蛋白作用后，引起F蛋白空间构象的改变，进而引发病毒包膜和细胞膜 的融合。我们研究表明，体外表达HN蛋白和F蛋白具有促进细胞与细胞之间形成多核巨细 胞，导致细胞死亡的功能，基于此发现，将HN和F基因共转染靶细胞是一种潜在的基因治疗 策略。 基因治疗是指将正常基因或有治疗作用的基因引入肿瘤细胞或体细胞以纠正突 变或有缺陷的基因或表达相应的效应分子，从而达到治疗疾病的目的。目前，基因治疗的主 要方法包括基因沉默疗法、自杀基因疗法、免疫基因疗法、基因替代疗法、反义基因疗法、 多药耐药相关基因治疗、抗肿瘤新生血管治疗、抗端粒酶治疗和凋亡诱导疗法等。常见报道 的治疗基因有TRAIL、caspase-3、凋亡素、抑癌基因和细胞因子基因等。如凋亡素是鸡贫血 病毒的vp3基因编码的蛋白质，体外合成或基因工程表达的凋亡素能特异地引起多种人源 性恶性肿瘤细胞凋亡，对正常二倍体体细胞无作用。但目前治疗基因的种类仍有限，发现新 的、有效的治疗基因仍是基因治疗面临解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供新城疫病毒NDV-Italien株的HN和F基因及其在组织或细胞中进行同时表达，以作为一种疾病治疗的有效成分，用于基因治疗。 本专利技术的技术解决方案如下 —种新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，所述的F基因的cDNA是序列 表〈400>1的序列，F蛋白的氨基酸序列是序列表〈400>3的序列，HN基因的cDNA是序列表 〈400>2的序列，HN蛋白的氨基酸序列是序列表〈400>4的序列。 新城疫病毒NDV-Italien株HN蛋白和F蛋白，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病 的药物中的应用。 —种重组病毒载体，将包含HN或F基因完整开放读码框序列的片段分别连入病毒 载体中，可以在真核细胞中分别表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因，然后通 过体外转染或感染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中并且同时 表达两种编码产物。 重组病毒载体，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。 —种真核表达质粒，将包含HN或F基因完整开放读码框序列的片段分别连入真核表达质粒，可以在真核细胞中分别表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因或F基因，然后通过转染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。 真核表达质粒，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。 —种真核表达质粒，将包含HN和F基因完整开放读码框序列的片段连入含有内核糖体进入序列(internal ribosome entry site, IRES)的真核表达质粒中，可以在真核细胞中串联表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通过转染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。 真核表达质粒，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。 —种重组病毒载体，将包含HN和F基因完整开放读码框序列的片段通过内核糖体进入序列(internal ribosome entry site, IRES)连接后，连入病毒载体中，构建重组病毒载体，可以在真核细胞中串联表达新城疫病毒NDV-Italien株HN基因和F基因，然后通过体外转染或感染的方法，导入培养的人肿瘤细胞、转化细胞或细胞疾病模型中同时表达两种编码产物。 重组病毒载体，作为制备治疗人体肿瘤或其他疾病的药物中的应用。 我们研究表明，将HN和F基因克隆、同时在体外转染肿瘤细胞或成纤维细胞，可以 引起转染细胞之间相互融合，形成多核巨细胞，最终诱导多核巨细胞死亡。因此，HN基因和 F基因可以作为一种治疗人体肿瘤和其他疾病的潜在的治疗基因。本专利技术是基于新城疫病 毒HN和F蛋白具有促膜融合功能、进而诱导细胞死亡的作用而设计的。HN蛋白和F蛋白均 位于病毒包膜或者呈现在感染细胞膜表面，HN蛋白和F蛋白的一级结构编码氨基酸残基分 别有571和553个，是病毒毒力的主要决定蛋白。正常情况下，HN蛋白以二聚体的形式与 F蛋白形成复合物，但是当HN蛋白与细胞膜表面的唾液酸受体结合后，会导致蛋白变构，引 起复合物解体，使F蛋白的活性位点暴露，而与邻近细胞膜相互作用最终导致相邻两个细 胞膜的融合而形成多核细胞，这种形成的融合多核巨细胞最终均会导致细胞死亡崩解。同 时由于肿瘤细胞死亡后释放的大量肿瘤相关抗原被提呈到相关的效应细胞，可以同时增强 人体免疫系统对肿瘤的杀伤作用。 本专利技术的有益效果是本专利技术得到了可以单独或串联表达NDVItalien株HN和F 基因的真核表达质粒或重组病毒颗粒，使这两种基因能够在真核细胞，包括人体的肿瘤细 胞、转化细胞或异常细胞中同时表达其编码产物HN蛋白和F蛋白，并且这两种蛋白可以导 致感染细胞与细胞之间融合形成多核巨细胞，最终产生细胞死亡的细胞毒效应。附图说明 图1为免疫荧光法检测HN和F的促膜融合效应的结果。 图2为素木精_伊红染色显示HN和F的促膜融合效应的结果。 图3为HN和F促膜融合导致的细胞死亡效应的结果。 图4为HN和F基因真核表达质粒图谱以及HN和F基因的真核串联表达质粒 pIRES-HN/F图谱。 图5为HN禾P F基因的穿梭质粒pShuttle-CMV-HN和pShuttle-CMV-F图谱以及HN 和F基因真核串联表达的穿梭质粒pShuttle-CMV-HN/F图谱。 保藏证明 请求保藏的培养物名称新城疫病毒NDV-Italien 保藏编号CCTCC-V200908 收到日期2009年4月30日 保藏单位中国典型培养物保藏中心。具体实施例方式1材料 1. 1病毒和细胞株 强毒株NDV Italien由Volker Schirrmacher教授(德国癌症研究中心)馈赠。 人肝细胞肝癌细胞株FHCC98 非洲绿猴肾细胞株C0S-7 1. 2菌种与质粒 E.co本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新城疫病毒ＮＤＶ－Ｉｔａｌｉｅｎ株ＨＮ蛋白和Ｆ蛋白，其特征在于：所述的Ｆ蛋白ｃＤＮＡ是序列表＜４００＞１的序列，Ｆ蛋白的氨基酸序列是序列表＜４００＞３的序列，ＨＮ蛋白ｃＤＮＡ是序列表＜４００＞２的序列，ＨＮ蛋白的氨基酸序列是序列表＜４００＞４的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：边惠洁，陈志南，尉丁，冯浩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]
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