本发明专利技术公开用于检测猴痘病毒的LAMP引物组、试剂盒及其应用。本发明专利技术首先公开了用于检测猴痘病毒的LAMP引物组。本发明专利技术进一步公开了包含上述LAMP引物组的用于检测猴痘病毒的LAMP试剂盒及其应用。本发明专利技术以猴痘毒OPG002基因片段作为靶基因得到用于检测猴痘病毒的LAMP引物组，进一步建立了检测猴痘病毒的LAMP方法，该方法特异性强，不与牛痘病毒、痘苗病毒、山羊痘病毒等其它病毒发生交叉反应，特异性良好；检测操作简单，无需借助昂贵仪器；反应时间短，60min内即可完成反应；灵敏度高，可检测到25copies/μL的病毒基因组。测到25copies/μL的病毒基因组。测到25copies/μL的病毒基因组。
【技术实现步骤摘要】
用于检测猴痘病毒的LAMP引物组、试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及生物检测
更具体地，涉及用于检测猴痘病毒的LAMP引物组、试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)属痘病毒科(Poxviridae)、脊痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)、正痘病毒属(Orthopoxvirus)的猴痘病毒种。正痘病毒属还包括天花病毒(variola virus，VARV)、牛痘病毒(cow
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pox virus，CPXV)和痘苗病毒(vaccinia virus，VACV)。猴痘是由MPXV感染导致的人畜共患疾病，临床症状与天花相似，症状较轻。自1977年全球根除天花以来，MPXV成为威胁人类生命健康的重大隐患之一。2022年5月以来，多个非猴痘流行国家相继报告了猴痘确诊病例，引起了全球的广泛关注。为避免MPXV传入国内，亟需建立并储备猴痘病毒快检快筛方法，为猴痘疫情监测及防控提供切实的技术保障。
[0003]MPXV是一种有包膜的双链DNA病毒，基因组相对较大，约为197 000bp，编码190个开放阅读框(open reading frame，ORF)，构成病毒在细胞质中复制所需的大部分材料，与正痘病毒属的典型基因组结构一样，位于MPXV的中央编码区(central coding region sequence，CRS)高度保守，其两侧是包含反向末端重复(inverted terminal repeats，ITR)的可变末端。ITR主要由发夹结构、串联重复和一些ORF组成。其基因组序列与正痘病毒属其它病毒高度保守，血清学及病原学检测方法多存在交叉，不易进行鉴别诊断。
[0004]环介导等温核酸扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术利用3对不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等温条件下进行靶序列高效快速扩增，灵敏度及特异性均较高。中国专利申请CN102839224B于2012年公开了等温扩增检测猴痘病毒的试剂及等温扩增检测猴痘病毒的方法，但是该方法仅使用2对引物，即内引物和外引物，扩增效率较低，以致反应时间长达90min，并不具备快检技术优势。
[0005]因此，开发出一种用于检测猴痘病毒的省时、有效、低成本的LAMP引物及试剂盒对于猴痘病毒进行快速、准确检测具有重要的意义。
技术实现思路
[0006]本专利技术的一个目的在于提供一组具有高灵敏度、高特异性的用于检测猴痘病毒的LAMP引物组。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供一种包含上述LAMP引物组的用于检测猴痘病毒的LAMP试剂盒及其应用。
[0008]为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0009]本专利技术根据GenBank数据的猴痘病毒(MPXV)全基因组序列(登录号NC_003310.1)，将猴痘病毒OPG002基因片段作为靶基因，利用在线引物设计软件Primer Explore V5进行
特异性扩增引物，得到用于检测猴痘病毒的LAMP引物组；具体的：所述LAMP引物组包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQ ID NO.5所示的环引物LF。
[0010]在本专利技术的优选的实施方式，上述LAMP引物组中所述正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LF的摩尔比为1:1:8:8:4。
[0011]本专利技术还提供上述LAMP引物组在制备用于检测猴痘病毒的试剂或试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术进一步提供了一种用于检测猴痘病毒的LAMP试剂盒，该LAMP试剂盒包括上述LAMP引物组，即如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQ ID NO.5所示的环引物LF。
[0013]进一步，所述LAMP试剂盒还包括完成LAMP反应所需的其他试剂。这些试剂本领域技术人员可以根据需要进行购买或按照文献的方法进行配制。例如，所述试剂盒还包括LAMP反应液、DNA聚合酶、荧光染料或显色剂、阳性对照和阴性对照中的部分或全部。
[0014]本专利技术进一步还提供了利用上述LAMP引物组或LAMP试剂盒检测猴痘病毒的LAMP方法，该方法包括以下步骤：
[0015](1)获取待测样本基因组DNA或cDNA；
[0016](2)配制LAMP反应体系；其中，所述体系包含上述LAMP引物组或LAMP试剂盒；
[0017](3)扩增反应：将配制好的LAMP反应体系进行扩增反应，观察扩增曲线；
[0018](4)结果判读：根据扩增曲线判定检测结果，在反应时间内，如出现典型的“S”型扩增曲线则为阳性，如无典型的“S”型扩增曲线则为阴性。
[0019]进一步，所述扩增反应的条件为65℃恒温反应60min。
[0020]本专利技术的有益效果如下：
[0021]本专利技术以猴痘毒OPG002基因片段作为靶基因得到用于检测猴痘病毒的LAMP引物组，进一步建立了检测猴痘病毒的LAMP方法，该方法特异性强，不与牛痘病毒、痘苗病毒、山羊痘病毒等其它病毒发生交叉反应；检测操作简单，无需借助昂贵仪器；反应时间短，60min内即可完成反应；灵敏度高，可检测到25copies/μL的病毒基因组，与实验室建立的猴痘病毒荧光PCR方法灵敏度相当，经查资料，与文献中报道的猴痘病毒荧光PCR方法的灵敏度亦相当。
附图说明
[0022]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。
[0023]图1为引物量的优化结果，其中：1：LF 1μL，FIP/BIP各2μL；2：LF 1.5μL，FIP/BIP各2μL；3：LF 1.5μL，FIP/BIP各2.5μL；4：LF 1μL，FIP/BIP各2.5μL；5：LF 0.5μL，FIP/BIP各2.5μL；6：LF 0.5μL，FIP/BIP各2μL；7：LF 1μL，FIP/BIP各1.5μL；8：LF 0.5μL，FIP/BIP各1.5μL；9：LF 1.5μL，FIP/BIP各1.5μL。
[0024]图2为反应温度的优化结果，其中：1：65℃，2：64℃，3：63℃，4：66℃，5：62℃，6：61℃。
[0025]图3为荧光LAMP的特异性试验反应结果，其中：1：MPXV阳性标准品；2
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7：CPV、VACV、
GPV、LSDV、ECTV、阴性对照。
[0026]图4为荧光LAMP的灵敏度试验反应结果，其中：1
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7：0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测猴痘病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向外引物F3和反向外引物B3，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的正向内引物FIP和反向内引物BIP，以及如SEQ ID NO.5所示的环引物LF。2.根据权利要求1所述的LAMP引物组，其特征在于，所述正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和环引物LF的摩尔比为1:1:8:8:4。3.权利要求1或2所述的LAMP引物组在制备用于检测猴痘病毒的试剂或试剂盒中的应用。4.一种用于检测猴痘病毒的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒包括权利要求1或2所述的LAMP引物组。5.根据权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂盒还包括完成LAMP反应所需的其他试剂。6.根据权利要求5所述的LAMP试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁向芬，许晓琳，陈冬杰，孔玉方，吕继洲，王慧煜，张舟，吴绍强，林祥梅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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