无需逆转录多位点启动指数扩增的新冠病毒检测方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术涉及无需逆转录多位点启动指数扩增的新冠病毒检测方法、试剂盒及应用，属于分子生物学核酸检测技术。本发明专利技术方法由结合DNA特异识别新冠病毒RNA，经限制性内切酶BstNI切割释放触发DNA，在切刻限制性内切酶Nt.BstNBI、链置换Bst 2.0 DNA聚合酶共同作用下，结合特殊设计的模板DNA在恒温条件下启动指数扩增产生双链DNA，通过嵌入性核酸染料实时监测荧光曲线变化，完成新冠病毒的检测。该方法在一次反应中对多个位点同时进行检测，检测的灵敏度高（约100拷贝/ml），检测时间短（<10分钟），可用于新冠病毒快速检测。可用于新冠病毒快速检测。可用于新冠病毒快速检测。

【技术实现步骤摘要】
无需逆转录多位点启动指数扩增的新冠病毒检测方法、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学核酸检测技术，具体涉及一种无需逆转录多位点启动指数扩增的新冠病毒快速检测的方法及其应用。

技术介绍

[0002]新冠病毒属于冠状病毒科、冠状病毒属，基因组为单链RNA，包括11段编码序列，全长~29.9 kb。
[0003]新冠病毒的检测方法主要有核酸检测、抗原检测和分离病原体。虽然抗原检测操作便捷、检测迅速，但是抗原检出率较低，有“假阳性”和“假阴性”的局限性；病原体分离过程繁琐，并且需要专业的科研人员在专门的实验室才能够开展，因此，这些方法均不适用于新冠病毒大规模和快速检测；核酸检测具有灵敏度高、特异性好、检测方法易于建立等诸多优点，是新冠病毒检测的主要方法。
[0004]逆转录
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荧光定量PCR是新冠病毒核酸检测的“金标准”，但是该方法检测时间长达3~4小时，不能满足快速检测的需求；虽然恒温扩增方法如环介导等温扩增方法（LAMP），可以缩短检测时间至1~2小时，效率依然不高，并且其存在一定的假阳性，准确性较差。

技术实现思路

[0005]为了解决新冠病毒检测时间长、检测速度慢的问题，本专利技术的目的一在于提供一种无需逆转录多位点启动指数扩增的新冠病毒检测方法，目的二在于提供一种试剂盒，目的三在于提供所述试剂盒的应用。本专利技术提供一种无需逆转录（减少反应步骤，缩短检测时间）、直接进行新冠病毒RNA检测的方法，该方法由结合DNA特异识别新冠病毒RAN，经限制性内切酶BstNI切割释放触发DNA，在切刻限制性内切酶Nt.BstNBI、链置换Bst2.0 DNA聚合酶共同作用下，结合特殊设计的模板DNA在恒温条件下启动指数扩增产生双链DNA，通过嵌入性核酸染料实时监测荧光曲线变化，完成新冠病毒的检测。该方法在一次反应中对多个位点同时进行检测，检测的灵敏度高（约100拷贝/ml），检测时间短（<10分钟），可用于新冠病毒快速检测。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案为：第一方面，一种无需逆转录多位点启动指数扩增的新冠病毒检测方法，包括以下步骤：步骤一、结合DNA设计：根据新冠病毒的基因序列，选择含有BstNI识别位点且在新冠病毒各毒株中保守序列作为检测靶标，然后在所述检测靶标的反向互补序列的5
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端添加DNA序列AGGTCCTG，得到结合DNA序列；步骤二、模板DNA设计：所述模板DNA为单链DNA片段，包含两段与触发DNA反向互补序列，在两段序列中间由切刻限制性内切酶Nt.BstNBI的酶切位点隔开，其核苷酸序列如SEQ ID NO：08所示；所述触发DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：07所示；
步骤三、提取样本RNA，将所述样本RNA、阳性标准品、阴性标准品分别与结合DNA、模板DNA和反应试剂混合进行恒温扩增和荧光监测，反应结束后观察荧光曲线变化，以判断结果。
[0007]作为对上述检测方法的进一步优化，步骤一中，所述结合DNA包括三段单链DNA片段，分别为结合DNA1、结合DNA2和结合DNA3；所述结合DNA1与新冠病毒ORF1ab基因特异性结合，核苷酸序列如SEQ ID NO：04所示；所述结合DNA2与新冠病毒S基因特异性结合，核苷酸序列如SEQ ID NO：05所示；所述结合DNA3与新冠病毒N基因特异性结合，核苷酸序列如SEQ ID NO：06所示。
[0008]作为对上述检测方法的进一步优化，步骤三中，所述阳性标准品为含有新冠病毒待测片段RNA的假病毒，所述阴性标准品为无DNA酶、RNA酶的去离子水。
[0009]作为对上述检测方法的进一步优化，步骤三中，所述反应试剂包括：Bst 2.0 DNA 聚合酶、切刻限制性内切酶Nt.BstNB1、限制性内切酶BstNI、核酸染料SYBRTM GreenI 、10 nM dNTP、5 mg/mL 牛血清白蛋白BSA、1 mg/mL单链结合蛋白SSB、100 mM MgSO4、10
×
恒温扩增反应液（成分为：200 mM Tris
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HCl pH 7.9，300 mM (NH4)2SO4，150 mM KCl，0.05% Triton X100）。
[0010]更进一步地，所述恒温扩增和荧光监测的反应条件设置为：25℃ 15 s，然后50℃，30 min，每20秒收集一次荧光信号，检测通道为通道SYBRGreen I。
[0011]更进一步地，步骤三中，所述判断结果具体为：以饱和荧光强度二分之一作为检测阈值，当待测样本荧光强度达到荧光阈值时，其对应的检测时间记为Rt；待测样本Rt值＜1.0
×
102拷贝/ml假病毒Rt值时判定为阳性，介于1.0
×
102拷贝/ml的假病毒与阴性对照之间时判定为疑似，Rt值≥阴性时判定为阴性。
[0012]第二方面，一种新冠病毒检测试剂盒，包括以下试剂：结合DNA、模板DNA、Bst 2.0 DNA 聚合酶、切刻限制性内切酶Nt.BstNB1、限制性内切酶BstNI、核酸染料SYBRTM GreenI 、10 nM dNTP、5 mg/mL 牛血清白蛋白BSA、1 mg/mL单链结合蛋白SSB、100 mM MgSO4、10
×
恒温扩增反应液（成分为：200 mM Tris
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HCl pH 7.9，300 mM (NH4)2SO4，150 mM KCl，0.05% Triton X100）和阳性标准品、阴性标准品；所述结合DNA包括三段单链DNA片段，3
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端与病毒RNA完全匹配，分别与新冠病毒ORF1ab基因、S基因和N基因进行特异性结合，识别新冠病毒RNA，5
’
端添加DNA序列AGGTCCTG，在所述DNA序列AGGTCCTG末端是限制性内切酶BstNI的识别位点；三段所述单链DNA片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：04~06所示；所述模板DNA为一段单链DNA片段，其序列包含两段与触发DNA反向互补序列，在两段序列中间由切刻限制性内切酶Nt.BstNBI的酶切位点隔开，所述触发DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：07所示；所述模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述阳性标准品为含有新冠病毒待测片段RNA的假病毒，所述阴性标准品为无DNA酶、RNA酶的去离子水。
[0013]第三方面，上述检测方法或试剂盒在新冠病毒检测方面的应用。
[0014]本专利技术与现有技术相比，具有以下的主要突出效果和优点：本专利技术无需进行RNA转变为cDNA的逆转录过程，同时采用恒温扩增，避免了PCR中加热和冷却的步骤，极大的缩短检测时间。另外，模板DNA仅有30碱基，扩增分子小，指数扩
增放大反应可在极短时间（数秒内）就可以产生大量双链DNA产物；利用切刻限制性内切酶和链替代DNA聚合酶的生物活性，将DNA产物转换成触发DNA，继续与模板D本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
ID NO：07所示；所述模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述阳性标准品为含有新冠病毒待测片段RNA的假病毒，所述阴性标准品为无DNA酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：祖向阳，胡志刚，薛云，杜喆，魏亚菲，林思漫，徐苛岚，宋克纳，高伟娜，付东辽，张晓兰，黄磊，王新征，黄梦姣，陈新刚，王静静，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：