一种非洲猪瘟病毒鉴别检测方法技术

本发明专利技术提供一种特异性强、敏感性高、重复性好，可以快速、高效鉴别II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的双重qPCR方法，对其临床应用提供了有效的技术支持。支持。

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒鉴别检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及非洲猪瘟病毒的鉴别和检测。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、出血性和高度接触性传染病，所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率可高达100％，世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物疫病，中国也将其列为一类动物疫病。由于尚无有效的治疗药物和疫苗投入使用，疫情发生后，仅能依靠扑杀、消毒等基础措施进行防控，到目前为止扑杀生猪超过119.66万头，给中国生猪养殖业和国民经济带来巨大冲击。面对非洲猪瘟带来的威胁与挑战，除建立高水平的生物安全体系之外，开发出安全高效的非洲猪瘟疫苗对该病的防控具有重要作用。ASFV是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，病毒粒子呈二十面体对称，直径约为200nm，病毒基因组为170
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193kb，具有151
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167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。与其它的核质大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses,NCLDV)一样，ASFV编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等。随着对ASFV基因功能的不断探索，研究人员发现当敲除其某些毒力基因、多基因家族及免疫逃逸相关基因后，可显著降低病毒毒力或增加宿主的免疫应答，以此构建的基因缺失疫苗可以对强毒感染提供良好的免疫保护。其中美国构建的II型非洲猪瘟I177L基因缺失株在越南上市。对我国非洲猪瘟的监测造成巨大的压力，因此急需开发针对该疫苗株将来临床应用时配套的鉴别诊断方法。
[0003]ASFV常用的诊断方法包括病原学诊断、血清学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断可靠性高，但费时费力，需要高级别生物安全实验室，不适于大规模检测；血清学检测方法操作简便，其中酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
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22]和间接免疫荧光抗体试验(indirect fluorescent antibody assay，IFA)是最常用的检测方法；分子生物学诊断方法的准确性、灵敏度和特异性都较高，其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)因其高通量、易操作、耗时短等优点，成为是国际贸易中OIE指定的ASFV检测方法。
[0004]实时荧光定量PCR(quantitative Real
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time PCR，qPCR)方法将光谱技术引入到PCR反应中，通过荧光信号积累实时定量监测特异性扩增产物总量，较常规PCR方法具有更高的特异性和敏感性。研究人员以ASFV的P72等保守基因为靶标设计引物和探针建立的TaqManqPCR能准确、高效的特异性鉴别ASFV。此外，Felicity J Haines、史喜菊等人还进一步建立了同时鉴别ASFV与CSFV、PCV2、PRRSV等多种病毒的感染的双重或多重qPCR检测方法，可以一步快速、准确地鉴别检测不同病原体。
[0005]目前，在CN 113718058 A公开了一种区分检测CD2v基因缺失株、MGF基因缺失株以及CD2v基因和MGF基因缺失株的PCR检测方法、试剂盒；在CN 112646934 B中公开了一种鉴别B646L、EGFP和mCherry基因的多重荧光qPCR检测方法、试剂盒；大多是根据ASFV P72基因
设计的，无法区分II型ASFV野毒感染和I177L基因缺失株免疫。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了提供一种快速、准确区分II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的鉴别检测方法。
[0007]第一方面，本专利技术提供一组灵敏度和特异性较高的双重荧光定量PCR特异性引物。
[0008]所述双重荧光定量PCR特异性引物是用于鉴别检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株。
[0009]本专利技术引物设计根据GenBank中登录的非洲猪瘟CN/HLJ/18基因组序列(MK333180.1)和HLJ/18
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ΔI177L候选疫苗株的基因缺失策略，利用Primer premier 5.0软件选择P72基因(GenBank No.22220311)、I177L(GenBank No.41902005)基因区域分别设计的2对引物。
[0010]进一步的，所述II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR特异性引物组包括检测P72基因的上游引物a和下游引物a，检测I177L基因的上游引物b和下游引物b。
[0011]进一步的，所述P72基因的上游引物a和下游引物a核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述I177L基因的上游引物b和下游引物b核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。
[0012]第二方面，本专利技术还提供一组检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针组。
[0013]进一步的，所述II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针组分别是检测探针c和检测探针d；
[0014]所述探针c的核苷酸序列如SEQ ID No.5；探针d的核苷酸序列如SEQ ID No.6。
[0015]优选的，所述特异性荧光探针的荧光基团选自用FAM和/或ROX；所述特异性荧光探针的淬灭基团选自BHQ1和/或BHQ2。
[0016]在一种实施例中，选用FAM和ROX 2种5'修饰基团，其波长处于不同的光谱范围，相互干扰少，具有明显的区分效果和信号强度。
[0017]通过采用上述的引物组和检测探针组进行II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的鉴别时，对模板DNA的扩增效率更高，有利于得到敏感性更高、最低检测限更低的检测结果，从而使得检测结果更加准确。
[0018]第三方面，本专利技术提供一种区分II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括P72基因的上游引物a和下游引物a，I177L基因的上游引物b和下游引物b，检测探针组c和d，进一步所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、荧光定量PCR扩增试剂、阳性对照和阴性对照。
[0019]第四方面，本专利技术提供一种上述试剂盒的应用，采用如下的技术方案：一种上述试剂盒的应用，所述试剂盒用于II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株感染的鉴别检测。
[0020]第五方面，本专利技术还提供一种II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株双重荧光定量PCR检测方法，包括以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组灵敏度和特异性较高的双重荧光定量PCR特异性引物，所述双重荧光定量PCR特异性引物是用于鉴别检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株，其中特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～2和SEQ ID NO.3～4所示。2.一组检测检测II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的特异性荧光探针，其特征在于所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示。3.一种II型非洲猪瘟病毒I177L基因缺失株与II型非洲猪瘟病毒流行株的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括探针法荧光定量PCR预混液、阳性对照和阴性对照的一种或几种。5.权利要求1所述引物和/或权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，陈伟业，刘文兴，刘任强，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：